薄永恒，高迎春，陳 玲，陸慶泉，張呈軍，魏秀麗

(1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，濟(jì)南250022;2.山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250022)

氯霉素由Ehrlich等在1947年從委內(nèi)瑞拉鏈絲菌的培養(yǎng)液中提取獲得，現(xiàn)在基本使用化學(xué)合成法大量生產(chǎn)，已廣泛用于動(dòng)物各種傳染性疾病的治療，對(duì)各類(lèi)家禽、家畜、水產(chǎn)品及蜂蜜制品各種傳染性疾病的控制和治療起重要作用。由于氯霉素還可與人體線粒體的70S結(jié)合，因而也可抑制人體線粒體的蛋白合成，對(duì)人體產(chǎn)生毒性。氯霉素在動(dòng)物性食品中的殘留對(duì)人類(lèi)健康可以造成嚴(yán)重危害，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面［1］:(1)引起骨髓造血機(jī)能紊亂;(2)對(duì)早產(chǎn)兒和新生兒產(chǎn)生蓄積毒性;(3)引起胃腸道癥狀及口部炎癥;(4)其他不良反應(yīng)可引起視神經(jīng)炎、視力障礙、多發(fā)性神經(jīng)炎、神經(jīng)性耳聾以及嚴(yán)重失眠，有時(shí)發(fā)生中毒性精神病。基于以上危害，世界各國(guó)都對(duì)其做出了嚴(yán)格規(guī)定，嚴(yán)禁氯霉素在食源性動(dòng)物上使用，歐盟規(guī)定動(dòng)物源食品中氯霉素殘留的最低要求執(zhí)行限(MRPL)為0.3 μg/kg。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中把氯霉素列為禁用藥物［2］。

資料顯示［3－4］，氯霉素在動(dòng)物的肌肉組織中主要以原形藥代謝，而在肝臟、腎臟多以氯霉素(CAP)、氯霉素葡萄糖酸苷(CAPG)和Hyocroxyam－酰胺醇類(lèi)(HAP)及葡萄糖酸苷結(jié)合物等形式代謝。雖然已有相關(guān)氯霉素殘留檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)以及其他行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但由于農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的781號(hào)公告－2－2006的檢測(cè)動(dòng)物組織項(xiàng)目不足，特別是基于氯霉素在肝臟、腎臟代謝規(guī)律的以上新研究發(fā)現(xiàn)，本項(xiàng)目組根據(jù)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定與修訂［(2013)91］的要求制定了氯霉素殘留在動(dòng)物肝臟、腎臟的LC－MS/MS檢測(cè)方法，檢測(cè)方法快速、準(zhǔn)確，可以滿足大批量樣品高靈敏測(cè)定，以期為食品安全檢測(cè)提供可靠的確證檢測(cè)方法。

1 材料和方法

1.1 儀器 Acquity UPLC－Quattro Premier XETM質(zhì)譜聯(lián)用儀，Waters公司;Acquity UPLC BEH C18色譜柱(500mg/3cc)，Waters公司;AE260電子天平，Mettler Toledo公司;SIR4漩渦混合器，IKA公司;HY－4調(diào)速多用振蕩器，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(貝克曼公司)。

1.2 試劑 氯霉素對(duì)照品:含量≥98%(Dr.Ehrenstorfer公司);氯霉素－D5對(duì)照品:含量≥98.0%(Dr.Ehrenstorfer公司);β －葡萄糖醛酸苷酶，德國(guó)默克;甲醇、乙酸乙酯、正己烷為色譜純(Fisher公司);氨水為分析純;乙酸鈉為分析純;實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 稱(chēng)取10 mg氯霉素對(duì)照品，用甲醇溶解定容至100 mL，溶液濃度為100 μg/mL，－20 ℃保存，有效期1年。

1.3.2 氯霉素－D5標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 稱(chēng)取10 mg氯霉素－D5對(duì)照品，用甲醇溶解定容至100 mL，溶液濃度為100 μg/mL，－20℃以下保存，有效期1年。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液 用流動(dòng)相稀釋適量?jī)?chǔ)備液，氯霉素濃度為 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中內(nèi)標(biāo)氘代氯霉素濃度為5 ng/mL。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 UPLC－MS/MS 分析條件［5］Acquity UPLC BEH C18色譜柱，流動(dòng)相A相為甲醇，B相為水，梯度洗脫條件:0～3.5 min，10%A線性變化至90%;3.5～ 4.5 min，90%A線性變化至10%;4.5 ～6 min，維持 10%A。流速為 0.3 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。

電離電壓為3.1 kV;源溫為110℃;霧化溫度為400℃;錐孔氣流速為50 L/h;霧化氣流速為650 L/h;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式采集。確定各母離子大小的氯霉素與內(nèi)標(biāo)的掃描圖如圖1所示。氯霉素的定性、定量離子對(duì)及內(nèi)標(biāo)氘代氯霉素離子對(duì)、離子源、錐孔電壓和碰撞能量如表1所示。

圖1 氯霉素與內(nèi)標(biāo)的掃描圖

表1 氯霉素特征離子參考質(zhì)譜條件

1.4.2 樣品前處理

1.4.2.1 提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取(5±0.5)g均質(zhì)樣品，加入 20 mL 乙酸鈉緩沖液(10 mmol/L)，300 μL β－葡萄糖醛酸苷酶，于37℃溫育過(guò)夜17 h。酶解樣品中加入250 μL氯霉素－D5標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入15 mL乙酸乙酯，充分渦旋混勻，中速水平震蕩10 min，7000 r/min離心5 min，取上層有機(jī)層，旋蒸近干。依次加入正己烷、水各4.0 mL，充分渦旋，40℃水浴中靜置5 min分層，取水層備用。

1.4.2.2 凈化 取 C18固相萃取柱5 mL甲醇、5 mL水分別預(yù)洗，取備用液過(guò)柱，棄去流出液，用5 mL 20%甲醇水洗滌，抽干，5 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液，取上清液于50℃下氮?dú)獯蹈?，? mL 20%甲醇水溶液溶解，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，上機(jī)測(cè)試。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確量取氯霉素和氯霉素－D5的標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用流動(dòng)相稀釋?zhuān)渲瞥陕让顾貪舛葹?0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL，氯霉素－D5作為內(nèi)標(biāo)濃度為5 ng/mL，供液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測(cè)組分峰面積與氯霉素－D5峰面積的比值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)氯霉素濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.4.4 靈敏度 在空白牛、羊、豬、雞的肝臟、腎臟勻漿組織中分別添加氯霉素及氯霉素－D5標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別制成0.1、0.2 μg/kg 的2 個(gè)空白添加樣品，其中內(nèi)標(biāo)氘代氯霉素濃度為1 μg/kg，按確定的提取凈化方法處理后，經(jīng)UPLC－MS/MS檢測(cè)，觀察氯霉素色譜峰信噪比和對(duì)應(yīng)的藥物濃度，確定其檢測(cè)限和定量限。

1.4.5 準(zhǔn)確度與精密度 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在牛、羊、豬、雞的肝臟、腎臟的勻漿組織中添加3個(gè)不同濃度的氯霉素及氯霉素－D5進(jìn)行回收率試驗(yàn)。各濃度進(jìn)行5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，求批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 氯霉素濃度在0.5～10.0 ng/mL范圍內(nèi)，色譜峰面積有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 氯霉素溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法靈敏度 牛、羊、豬、雞的肝臟、腎臟的勻漿組織按上述方法進(jìn)行處理，氯霉素添加濃度為0.1 μg/kg 時(shí)，信噪比(S/N)均 ＞3，確定為方法的檢測(cè)限，氯霉素添加濃度為0.2 μg/kg時(shí)，信噪比(S/N)均＞10，確定為方法的最低定量限。其中豬肝空白組織中添加0.2 μg/kg氯霉素及相應(yīng)的空白組織的離子色譜圖，見(jiàn)圖3～圖4。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜見(jiàn)圖5。

圖3 豬肝空白試樣離子質(zhì)量色譜圖

圖4 豬肝空白添加氯霉素離子質(zhì)量色譜圖(0.2 μg/kg)

圖5 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液離子質(zhì)量色譜圖(1 ng/mL)

2.3 方法準(zhǔn)確度與精密度 各空白組織中在0.2、0.4、2 μg/kg 3 個(gè)不同添加濃度的氯霉素，其中內(nèi)標(biāo)為1 μg/kg，進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，回收率為70% ～120%;本方法批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%，準(zhǔn)確度和精密度均能滿足有關(guān)法規(guī)的要求。其中豬肝中添加氯霉素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組織中添加氯霉素的批內(nèi)平均回收率、批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 討論與小結(jié)

3.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化 1994年Heitzman通過(guò)飼喂實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氯霉素在動(dòng)物體內(nèi)的代謝消除存在很大差異，其代謝的共同點(diǎn)是肌肉組織中原形藥物最多，在牛和禽的肝臟組織中藥物的主要?dú)埩粜问绞锹让顾?CAP)、氯霉素葡萄糖酸苷(CAPG)和Hyocroxyam－phenicol(HAP)，豬的腎臟中多以葡萄糖酸苷結(jié)合物的形式存在［3］。因此，在提取肝臟、腎臟組織中的氯霉素時(shí)，考慮其葡萄糖酸苷結(jié)合物的存在，因此樣品加入了β－葡萄糖醛酸苷酶，以酶解其形成原形藥再做提取，從而使得檢測(cè)結(jié)果更加接近真值。提取時(shí)采取乙酸乙酯提取，20%甲醇水飽和正己烷液液萃取凈化的肉樣提取方法，也可以提取到氯霉素，但是由于肝腎細(xì)胞組織提取裂解后，很多細(xì)胞成分不能有效去除，而降低了色譜柱的柱效，減少了有效使用時(shí)間，甚至直接堵塞色譜柱，因此使用C18固相萃取柱凈化是必要的。

3.2 色譜方法的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)中使用了ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm × 50 mm)色譜柱，分別使用了甲醇/水和乙腈/水系統(tǒng)作為流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)甲醇/水液能得到良好的峰形，且具有更高的質(zhì)譜響應(yīng)，與已有報(bào)道的乙腈/水為流動(dòng)相不同［6－8］。同時(shí)為了使基質(zhì)中雜質(zhì)在色譜柱中充分洗脫，在5 min的洗脫基礎(chǔ)上，增加至6 min一個(gè)樣品。

3.3 質(zhì)譜方法優(yōu)化 通過(guò)單針將一定濃度的氯霉素及氯霉素－D5注入離子源，在負(fù)離子檢測(cè)方式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析、二級(jí)質(zhì)譜分析，得到母離子及子離子信息，然后對(duì)錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量等進(jìn)行優(yōu)化，使樣液中的離子化效率達(dá)到最佳。

本方法檢測(cè)豬、牛、羊、雞肝臟、腎臟試料中殘留的氯霉素含量，用β－葡萄糖醛酸苷酶酶解后乙酸乙酯提取，C18固相萃取柱凈化，液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜負(fù)離子模式測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量，成功建立了動(dòng)物性食品的肝臟、腎臟組織中氯霉素的殘留檢測(cè)方法。氯霉素的檢測(cè)限為 0.1 μg/kg，最低定量限為0.2 μg/kg。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單、快速，回收率較高，適合樣品動(dòng)物性食品中氯霉素殘留的定量檢測(cè)。

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