馮宋崗，曾建國(guó)

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，長(zhǎng)沙410128)

博落回(Macleaya cordata(willd.)R.Br)隸屬罌粟科，多年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)的湖南等?。?］。血根堿(Sanguinarine，SA)與白屈菜紅堿(Chelerythrine，CHE)［2］為其主要活性成分之一。SA和CHE屬于季胺苯并菲啶類生物堿(QBAs)，是芐基異喹啉類生物堿中的一類［3－4］，具有抑菌［5－6］、抗炎［7］等效果。在歐洲，博落回提取物(Sangrovit?)已作為植物源性飼料添加劑使用多年［8］。在我國(guó)，博落回散已成功地被開(kāi)發(fā)為我國(guó)第一個(gè)二類新中獸藥，并作為首個(gè)中獸藥藥物飼料添加劑批準(zhǔn)使用，可視為后抗生素時(shí)代為解決飼用抗生素替代技術(shù)和產(chǎn)品。本研究以飼喂添加博落回散的飼料的豬為研究對(duì)象，對(duì)其中SA和CHE的藥物殘留檢測(cè)前處理?xiàng)l件和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)豬肉中SA和CHE藥物殘留的方法，并為進(jìn)一步驗(yàn)證博落回散作為藥物飼料添加劑使用的安全性研究提供方法借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 甲酸(質(zhì)譜級(jí)，上海安譜科學(xué)儀器有限公司);甲醇(色譜純，Merk，Darmstadt，Germany);鹽酸(分析級(jí)，國(guó)藥集團(tuán));乙腈(色譜純，Merk，Darmstadt，Germany);水(Milli－ Q);正己烷(分析級(jí)，國(guó)藥集團(tuán))。血根堿對(duì)照品(批號(hào):201101，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，白屈菜紅堿(批號(hào):111718－200501，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。博落回散(批號(hào):1303023，湖南美可達(dá)生物資源有限公司，規(guī)格:血根堿≥1.5%)。豬肉:實(shí)驗(yàn)組為以博落回散作飼料添加劑的飼料(每噸添加博落回散40 g)飼喂90 d后屠宰采集;空白對(duì)照為不飼喂添加博落回散的豬肉樣品。

1.2 儀器 高效液相色譜－串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(HPLC－MS/MS)(美國(guó) Agilent公司，6460型);Milli－Q Advantage A10系統(tǒng)(美國(guó) MILLPORE公司);KQ5200DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);ML204/02型精密天平(梅特勒－托利多(上海)儀器有限公司);渦旋混勻器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司;低溫高速離心機(jī)(Hermle公司);氮吹儀(北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液制備 對(duì)照品稱重前在干燥器中干燥，精密稱取血根堿、白屈菜紅堿各10 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容配制得0.1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，將儲(chǔ)備液甲醇稀釋1000倍，制得血根堿和白屈菜紅堿均為100 ng/mL，保存于4℃。

1.3.2 供試品溶液制備 精密稱取豬肌肉1 g于50 mL的離心管中，加超純水2 mL，勻漿機(jī)勻漿，加入1%鹽酸－甲醇(10∶90，V/V)溶液15 mL，渦旋3 min，超聲萃取 20 min，10000 r/min冷凍離心10 min，上清液移入另一50 mL的離心管中;沉淀物加10 mL 1%鹽酸－甲醇(10∶90，V/V)溶液按上述方法提取，重復(fù)兩次;將三次提取的上清液合并，加10 mL正己烷脫脂，渦旋2 min，10000 r/min冷凍離心2 min，棄去上層正己烷相，剩余液體在50℃水浴下氮?dú)獯蹈?，? mL甲醇復(fù)溶，12000 r/min冷凍離心10 min，上清液過(guò)0.22 μm 有機(jī)膜;待供試液。

1.3.3 液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定條件 色譜柱:Agilent Poroshell 120 EC C18(2.1 mm ×150 mm，2.7 μm);流動(dòng)相A 為0.2%甲酸溶液，流動(dòng)相B 為乙腈;梯度洗脫:0～8 min，28% ～50%B;8～16 min，50% ～28%B;柱溫 35 ℃;流速 0.3 mL/min;進(jìn)樣量 2 μL。

離子源:電噴霧離子源(ESI);毛細(xì)管電壓:4 kV;離子源溫度:300℃;EMV:200 V;正離子模式;脫溶劑氣和霧化氣為高純氮?dú)?，脫溶劑氣溫?350℃;脫溶劑氣流量:10 L/min;霧化氣壓力:45 psi;檢測(cè)方式:多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);碰撞能量、定性離子對(duì)及定量離子對(duì)等參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 血根堿和白屈菜紅堿的色譜保留時(shí)間和定性、定量離子參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察和定量限 精密量取100 ng/mL的對(duì)照品溶液 0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。按照上述1.3.3項(xiàng)，測(cè)定 SA和 CHE的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程分別為血根堿Y=489.87X － 107.87 ，R2=0.9996 ，白屈菜紅堿Y=1101.2X －192.35 ，R2=0.9995 ，結(jié)果表明SA 和CHE質(zhì)量濃度在0.5～50 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋，按照上述1.3.3項(xiàng)對(duì)稀釋樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度S與背景信號(hào)強(qiáng)度N的比值，即信噪比，當(dāng)S/N=10時(shí)樣品的最低濃度為最低定量限。經(jīng)測(cè)定，本方法SA和CHE的定量限分別為0.01 ng/mL和0.04 ng/mL。

2.2 重復(fù)性和精密度 精密稱取同一頭豬同一部位肌肉6份，按照1.3.2項(xiàng)制備供試品溶液，并按照1.3.3項(xiàng)進(jìn)行檢測(cè)分析，計(jì)算得到豬肉中SA和CHE的平均含量為4.75 ng/g和2.10 ng/g。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD/%)為11.68%和9.90%，結(jié)果表示該方法重復(fù)性良好，取供試液一份，按1.3.3項(xiàng)方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算得SA、CHE的平均含量分別為為5.22 ng/g，2.35 ng/g，RSD 分別為2.58%和3.89%，表明儀器的精密度良好。

2.3 方法的專屬性 分別設(shè)置空白豬肉樣品組、空白豬肉樣品加SA和CHE對(duì)照品組、飼喂添加了博落回散的豬肉樣品組。按1.3.2項(xiàng)對(duì)三組樣品分別制備供試液，并按1.3.3項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖1、圖2、圖3、圖4所示，通過(guò)圖可以看出，SA、CHE峰型良好，且在豬肉中無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。空白豬肉樣品組未發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰，表明該方法的專屬性較好。

圖1 空白豬肉樣品加SA和CHE對(duì)照品組色譜圖

圖2 飼喂添加了博落回散的豬肉樣品組色譜圖

圖3 血根堿的子離子質(zhì)譜圖

圖4 白屈菜紅堿的子離子質(zhì)譜圖

2.4 回收率測(cè)定 在豬肉樣品中添加SA、CHE標(biāo)準(zhǔn)溶液，按 1.3.2 項(xiàng)制備供試品溶液，按 1.3.3 項(xiàng)進(jìn)行檢測(cè)分析，對(duì)豬肉樣品進(jìn)行3個(gè)含量水平的加樣回收實(shí)驗(yàn)(每個(gè)加標(biāo)濃度測(cè)3個(gè)平行樣)，3個(gè)含量水平分別為8、10、12 ng/g。結(jié)果如表2所示，從表2可以看出，本方法SA的回收率在88.5% ～94.1%之間，平均回收率為91.5%，CHE的回收率在87.9% ～93.4%，平均回收率為 91.3%，表明方法具有較好的準(zhǔn)確度。

表2 SA和CHE加標(biāo)回收率

2.5 樣品檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組豬各6頭，屠宰取樣，每份樣品做兩個(gè)平行，按照1.3.2項(xiàng)制備供試品溶液，按1.3.3項(xiàng)進(jìn)行檢測(cè)分析，平行樣本取平均值，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出，血根堿和白屈菜紅堿在6頭豬的肌肉中的平均殘留量為4.76 ng/g和 2.09 ng/g。

表3 豬肌肉中SA、CHE殘留量檢測(cè)結(jié)果 ng/g

3 討論與小結(jié)

近年來(lái)，食源性動(dòng)物產(chǎn)品的食品安全問(wèn)題已成為社會(huì)的一個(gè)焦點(diǎn)問(wèn)題，藥物使用過(guò)程中違禁或超規(guī)定劑量使用藥物，及添加未標(biāo)示藥物成分等違規(guī)添加和濫用的現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重。中獸藥作為近幾年發(fā)展起來(lái)的全新方向，其有效活性成分也主要是植物次生代謝產(chǎn)物如生物堿、黃酮等，因此，對(duì)其在動(dòng)物體內(nèi)的殘留進(jìn)行前瞻性的深入研究，進(jìn)一步詮釋其作為飼料添加劑的安全性很有必要。

因血根堿本身帶正電荷對(duì)質(zhì)譜離子源有一定的污染，研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)空白樣品有時(shí)也有極低的陽(yáng)性響應(yīng)，因此需要每次檢測(cè)前進(jìn)空白溶劑，驗(yàn)證儀器系統(tǒng)沒(méi)有被污染，每次檢測(cè)結(jié)束后，對(duì)離子源進(jìn)行仔細(xì)清理。本研究對(duì)樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)1%鹽酸－甲醇(10∶90，V/V)的提取和沉淀蛋白效果最好，重復(fù)三次的提取能夠很大程度的提高加樣回收率。

本實(shí)驗(yàn)以SA和CHE為測(cè)試對(duì)象，通過(guò)對(duì)樣品前處理?xiàng)l件及HPLC－MS/MS檢測(cè)條件的優(yōu)化，建立了豬肉中QBAs殘留量的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法。該方法具有前處理較為簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，靈敏度及定量準(zhǔn)確高和專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)，方法學(xué)驗(yàn)證的各項(xiàng)指標(biāo)均可達(dá)到實(shí)際樣品的檢測(cè)要求，可用于豬肉中痕量QBAs的殘留檢測(cè)。

［1］ 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編委會(huì).中國(guó)植物志［M］.北京:科學(xué)出版社，1999:78.

［2］ 孫麗艷，魏雄輝，韋 宇.博落回總生物堿提取方法的研究［J］.藥物分析雜志，2003，23(1):15－18.

［3］ Pavel Kosina，Daniela Walterova，Jitka Ulrichovaet，et al.Sanguinarine and chelerythrine:assessment of safety on pigs in ninety days feeding experiment［J］.Food ＆ Chemical Toxicology，2004，42(1):85 －91.

［4］ Kosina P，Pavel Kosina，Jan Vacek，et al.Identification of benzo［c］phenanthridine metabolites in human hepatocytes by liquid chromatography with electrospray ion－trap and quadrupole time－ of－ flight mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography B，2011，879(15/16):1077－1085.

［5］ 趙東亮，郁建平，周曉秋，等.博落回生物堿的抑菌作用研究［J］.食品科學(xué)，2005，26(1):45 －47.

［6］ 徐 麗，曾建國(guó)，程 辟，等.血根堿－黃芩苷、白屈菜紅堿－黃芩苷離子對(duì)化合物體外抗菌活性和急性毒性研究［J］.中南藥學(xué)，2012，1:4.

［7］ Steven E Newman，Michael J Roll.A Naturally Occurring Compound for Controlling Powdery Mildew of Greenhouse Roses［J］.Hort Science，1999，34(4):686 －689.

［8］ Franz C，Bauer R，Tedesco D，et al.CFT/EFSA/FEEDAP/2005/.2005.01:P.140 －152［S］.