周 煒，陳慧華，應(yīng)永飛，陸春波，林仙軍，朱聰英

(浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，杭州310020)

2013年3月，本實(shí)驗(yàn)室收到某品牌獸藥樣品若干，經(jīng)調(diào)查這些獸藥明顯具有標(biāo)簽外藥物的生理/藥理學(xué)作用，即可明顯促進(jìn)育肥豬采食、提高出肉率，但具體是其中哪種藥及具體成分不明。為配合相關(guān)行政執(zhí)法部門(mén)嚴(yán)厲打擊畜產(chǎn)品質(zhì)量安全犯罪、超范圍濫用獸藥等違法行為，保障畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，急需對(duì)其中非法添加的未知成分進(jìn)行篩查與確證。

目前，國(guó)際上多用核磁法和飛行時(shí)間質(zhì)譜法等技術(shù)對(duì)某種未知成分進(jìn)行定性分析［1-2］。但這些技術(shù)對(duì)儀器的要求，限制了其應(yīng)用與推廣。自20世紀(jì)50年代開(kāi)始，基于常規(guī)四級(jí)桿質(zhì)譜發(fā)展而來(lái)的四級(jí)桿/線性離子阱質(zhì)譜技術(shù)日趨成熟［3-4］，已廣泛應(yīng)用于檢驗(yàn)檢測(cè)領(lǐng)域。針對(duì)離子阱可進(jìn)行選擇性離子富集與裂解功能而研發(fā)的增強(qiáng)子離子掃描(Enhanced Product Ion Scan，EPI)技術(shù)，可根據(jù)可疑目標(biāo)化合物的質(zhì)荷比、裂解規(guī)律等參數(shù)，自動(dòng)與已建譜庫(kù)中的化合物進(jìn)行匹配分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)化合物的確證與測(cè)定［5-6］。然而，迄今為止，利用四極桿/線性離子阱質(zhì)譜對(duì)未知物進(jìn)行篩查的方法鮮有報(bào)道。本研究旨在以如何確證上述獸藥中非法添加氯丙那林的過(guò)程為例，初步探討了四級(jí)桿/線性離子阱質(zhì)譜在獸藥非法添加物篩查中的運(yùn)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilent 1290N高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);AB 5500 Q-Trap質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司)，配電噴霧離子源(ESI);電子天平(瑞士Mettler，精度十萬(wàn)分之一);離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)。

1.1.2 試劑與藥品 試驗(yàn)用甲醇、乙腈、醋酸鉛均為分析純，甲酸及作為流動(dòng)相的甲醇均為色譜純，水為超純水。氯丙那林(Clorprenaline，CLN)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Witega公司。所檢陽(yáng)性樣品(包含:水性溶劑注射液、非水性溶劑注射液和中獸藥散劑等三種劑型)及相應(yīng)陰性對(duì)照樣品均來(lái)自公安和農(nóng)業(yè)行政執(zhí)法部門(mén)。

1.1.3 EPI譜庫(kù) 本實(shí)驗(yàn)室已對(duì)激素類、鎮(zhèn)定劑/抑郁藥類、脫羧酶抑制劑類、中樞神經(jīng)興奮劑類、抗病毒類等五大類藥物進(jìn)行了EPI譜庫(kù)建立，譜庫(kù)中“瘦肉精”類藥物包括:馬噴特羅、溴代克倫特羅、克倫塞羅、克倫異磅特羅、克倫潘特、羥甲基克倫特羅、Clenhexerol、馬布特羅、妥布特羅、溴布特羅、氯丙那林、噴布特羅、西布特羅、特布他林、非諾特羅、克倫普羅、西馬特羅、萊克多巴胺、齊帕特羅、班布特羅、沙丁胺醇、丙卡特羅、克倫特羅、福莫特羅(阿福特羅)、苯乙醇胺A等25種藥物。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 結(jié)合目標(biāo)化合物的生物學(xué)功用，推測(cè)其極有可能屬于“瘦肉精”類化合物。由于“瘦肉精”類化合物多易溶于水，故本試驗(yàn)均采用水溶性目標(biāo)化合物處理方法。

水性溶劑注射液:量取供試品適量，用0.2%甲酸水稀釋依次成100倍、104倍和106倍稀釋液，按濃度從低到高過(guò)膜上機(jī)，直至檢測(cè)濃度適宜為止。

非水性溶劑注射液與中獸藥散劑:取相應(yīng)供試品適量(非水性溶劑注射液:5.0 mL;中獸藥散劑:5.0 g)于50 mL離心管中，加入20 mL 0.2%甲酸水，水浴超聲提取30 min，期間每5 min振搖1次。12000 r/min離心10 min，取上清液適量，用0.2%甲酸水稀釋依次成100倍、104倍和106倍稀釋液，按濃度從低到高過(guò)膜上機(jī)，直至檢測(cè)濃度適宜為止。

1.2.2 靶目標(biāo)分子篩查方法 為得到目標(biāo)化合物的分子質(zhì)量數(shù)信息，本研究采用Q3全掃描方式，通過(guò)比較樣品與陰性對(duì)照的差異，獲取靶目標(biāo)化合物的分子質(zhì)量。

質(zhì)譜條件:采集模式為蠕動(dòng)泵進(jìn)樣，ESI+模式Q3全掃描;泵流速為5 μL/min;離子源電壓5500 V;輔助加熱氣溫度550℃;氣簾氣流速40 L/h;離子源氣流流速霧化氣(Gas1)15 L/h、輔助氣(Gas2)20 L/h;DP(Declustering Potential，去簇電壓)50 eV;碰撞室入口電壓(Entrance Potential，EP)10 eV;碰撞室出口電壓(Collision Cell Exit Potential，CXP)10 eV;掃描速率200 Da/s。

1.2.3 靶目標(biāo)分子質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化 為得到質(zhì)荷比為214.2 Da的靶目標(biāo)分子準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)及MRM(Multiple Reaction Monitoring)模式下的質(zhì)譜參數(shù)，本試驗(yàn)先用0.2%甲酸水/甲醇/乙腈(50∶25∶25，V/V)對(duì)Q3全掃描上機(jī)液進(jìn)行了10倍稀釋，并依次優(yōu)化了DP、EP、母離子質(zhì)荷比、兩特征子離子的碰撞能量(Collision Energy，CE)、CXP與子離子質(zhì)荷比等參數(shù)。

1.2.4 靶目標(biāo)分子的色譜分離 在篩查得到靶目標(biāo)分子母離子質(zhì)荷比后，初步驗(yàn)證了其屬于“瘦肉精”類物質(zhì)的推測(cè)，適用未知物篩查ESI+模式下的通用色譜條件進(jìn)行分離。色譜條件:色譜柱:Waters Atlantis dC18 柱(3.0 mm ×150 mm，粒徑3 μm);流動(dòng)相及流速見(jiàn)表1;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:5 μL。

表1 通用流動(dòng)相和流速

根據(jù)靶目標(biāo)分子的保留時(shí)間與洗脫特性，對(duì)流動(dòng)相組成進(jìn)行了適當(dāng)優(yōu)化，以得到最佳色譜條件。優(yōu)化后的流動(dòng)相見(jiàn)表2。

表2 流動(dòng)相組成和流速

1.2.5 靶目標(biāo)分子的定性確證方法 在優(yōu)化了色譜條件后，本試驗(yàn)用儀器自帶的“MRM-IDA(Information Dependent Acquistion)-EPI”(多反應(yīng)監(jiān)測(cè)觸發(fā)增強(qiáng)子離子掃描)技術(shù)進(jìn)行了譜庫(kù)匹配檢索，以進(jìn)一步作定性確證。

質(zhì)譜條件:MRM條件電噴霧離子源;正離子掃描;多反應(yīng)監(jiān)測(cè);離子源電壓:5500 V;碰撞氣能量:高;輔助加熱氣溫度:550℃;氣簾氣流速:40 L/h;離子源氣流流速:Gas1為50 L/h，Gas2為35 L/h。目標(biāo)化合物MRM參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件

IDA條件［5-6］:進(jìn)行IDA監(jiān)測(cè)時(shí)允許質(zhì)量數(shù)偏離范圍為±250 mDa;啟用動(dòng)態(tài)背景扣除(MRM響應(yīng)值超出5000 cps，選擇1個(gè)最強(qiáng)離子觸發(fā)IDAEPI);當(dāng)MRM到達(dá)已建庫(kù)化合物的保留時(shí)間且響應(yīng)值超出6000 cps，強(qiáng)制1個(gè)最強(qiáng)離子觸發(fā)IDA-EPI。

EPI條件:掃描速率10000 Da/s;進(jìn)行 EPI時(shí)CE為35、(35±15)eV(即最終所獲得的EPI譜圖為20、35、50 eV三個(gè)水平的碰撞能量下的疊加圖)。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶目標(biāo)分子量篩查 本試驗(yàn)通過(guò)陰性對(duì)照的方法，尋找樣品譜圖中除陰性對(duì)照樣品峰外的特征離子峰，對(duì)靶目標(biāo)母離子質(zhì)荷比進(jìn)行篩查。由于四極桿質(zhì)譜中Q1部分，對(duì)質(zhì)量數(shù)的定量不能滿足試驗(yàn)要求，因而采用Q2不進(jìn)行碰撞裂解的Q3全掃描。掃描結(jié)果如圖1、圖2所示，所檢“扶正解毒散”樣品色譜圖中在214.2 Da處有明顯特征離子峰，與氯丙那林母離子質(zhì)荷比(213.7 Da)相近。

圖1 陰性對(duì)照樣品Q3掃描圖

圖2 樣品Q3掃描圖

2.2 靶目標(biāo)分子的色譜分離 為保障高通量定性分析的可比性，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)雌激素類、同化激素、鎮(zhèn)定劑/抑郁藥類、受體激動(dòng)劑類、抗病毒類等均用ESI+離子源模式進(jìn)行電離的藥物，建立了通用流動(dòng)相條件，以便于直接進(jìn)行MRM-IDA-EPI譜庫(kù)檢索。在初步得到驗(yàn)證結(jié)果后，再對(duì)流動(dòng)相條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，然后在該流動(dòng)相條件下對(duì)靶目標(biāo)分子與標(biāo)準(zhǔn)物的譜圖進(jìn)行匹配度查詢。通用模式下靶目標(biāo)化合物的離子流圖見(jiàn)圖3，優(yōu)化流動(dòng)相及稀釋倍數(shù)后的靶目標(biāo)化合物的離子流圖見(jiàn)圖4。如圖4所示，經(jīng)優(yōu)化條件后，靶目標(biāo)化合物與基質(zhì)得到了良好分離。

2.3 靶目標(biāo)分子的定性確證 如圖5、圖6所示，在優(yōu)化色譜條件后，靶目標(biāo)化合物的保留時(shí)間(6.92 min)與氯丙那林對(duì)照品的保留時(shí)間(6.93 min)一致，均有質(zhì)荷比為 154.1 Da、119.0 Da、91.0 Da 和76.9 Da特征碎片離子，且這四個(gè)特征碎片離子的峰度比也高度一致。從圖7中可以看出，EPI譜庫(kù)檢索匹配度為93.2，遠(yuǎn)大于80的判定標(biāo)準(zhǔn)［7-8］。根據(jù)歐盟2002/657/EC決議要求，共獲得7個(gè)識(shí)別點(diǎn)［7］，遠(yuǎn)高于歐盟96/23/EC指令附錄I的A組的物質(zhì)(β-興奮劑)確認(rèn)要求(4個(gè)識(shí)別點(diǎn))［9］?；谌缟辖Y(jié)果，該靶目標(biāo)化合物可定性為氯丙那林。

圖3 通用模式下的總離子流圖

圖4 優(yōu)化參數(shù)后的總離子流及CLN提取離子流圖

圖5 靶目標(biāo)化合物的MRM譜圖(圖A)和EPI譜圖(圖B)

圖6 氯丙那林標(biāo)準(zhǔn)品的MRM譜圖(圖A)與EPI譜圖(圖B)

圖7 靶目標(biāo)化合物與氯丙那林標(biāo)準(zhǔn)品的EPI譜圖匹配度結(jié)果圖

3 討論

本研究以定性確證某品牌獸藥中非法添加有氯丙那林的過(guò)程為例，建立了一整套利用高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿/線性離子阱質(zhì)譜對(duì)獸藥中非法添加物進(jìn)行定性確證的方法，即:先從基質(zhì)中提取目標(biāo)化合物，利用Q3全掃描得到其分子質(zhì)量數(shù)，隨后對(duì)其HPLC、MRM參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最后利用EPI譜庫(kù)檢索進(jìn)行定性確證。

利用四級(jí)桿/線性離子阱進(jìn)行未知物篩查與驗(yàn)證，過(guò)程可分為T(mén)arget Scan和Non-target Scan兩種方式進(jìn)行。Target Scan是基于已知目標(biāo)化合物可能的生理/藥理學(xué)作用一類篩查方法，主要通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)、類似物分析兩種方法進(jìn)行。Non-target Scan是針對(duì)完全未知物的一類篩查方法［3］，目前主要通過(guò)特征離子的質(zhì)量與結(jié)構(gòu)，結(jié)合這些結(jié)構(gòu)潛在的生理、藥理學(xué)作用、經(jīng)濟(jì)價(jià)值等情況進(jìn)行。

本研究建立了一整套從獸藥中篩查并確證非法添加物的Target Scan方法。對(duì)于已建立譜庫(kù)的非法添加物或超標(biāo)簽范圍使用的化學(xué)成分，可利用此方法對(duì)獸藥、飼料及畜產(chǎn)品開(kāi)展針對(duì)性篩查。同時(shí)，這一方法對(duì)于這些藥物的同系物或類似物的篩查也具有一定指導(dǎo)性意義。就Non-target Scan方法而言，還需要在樣品前處理過(guò)程中引入有機(jī)溶劑提取處理，在Q3全掃描和MRM方法建立時(shí)引入ESI-模式等處理方法以拓寬篩查范圍。此外，無(wú)論是Target Scan，還是Non-target Scan，尋找合適的陰性對(duì)照物、探明靶目標(biāo)化合物可能的生理/藥理學(xué)作用對(duì)于畜產(chǎn)品及相關(guān)投入品中未知物的篩查均有著至關(guān)重要的意義。

由于四級(jí)桿/線性離子阱質(zhì)譜仍屬低分辯質(zhì)譜，無(wú)法獲得飛行時(shí)間質(zhì)譜等高分辯質(zhì)譜分析時(shí)所能得到的離子精確質(zhì)量數(shù)和高通量同時(shí)掃描［1］，因而目前還只能依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及譜庫(kù)的建立，而譜庫(kù)的建立又需要長(zhǎng)期的積累與維護(hù)。

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