謝文靜，張 萍，石彥鵬

（寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川750101）

泰樂菌素，又名泰樂星，是一類16元大環(huán)內(nèi)酯類畜禽專用抗生素，它的產(chǎn)生菌有弗氏鏈霉菌、龜裂鏈霉菌和吸水鏈霉菌，其中弗氏鏈霉菌是泰樂菌素的主要產(chǎn)生菌，也是其工業(yè)化生產(chǎn)菌株。泰樂菌素主要由泰樂菌素A、脫碳霉糖泰樂菌素B、大菌素C和雷洛菌素D四種組分構(gòu)成，其中泰樂菌素A為主要組分，且生物活性最高。細胞膜不僅是高度選擇性的屏障［1］，把細胞質(zhì)與外界環(huán)境分隔開，使細胞獲得一個相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，而且它在細胞與環(huán)境之間的物質(zhì)交換、能量轉(zhuǎn)換和信號傳導(dǎo)等過程中也起著重要作用［2］。在泰樂菌素的發(fā)酵過程中，細胞膜的通透性是影響菌體對氧及營養(yǎng)物質(zhì)利用的重要因素，對泰樂菌素產(chǎn)能及產(chǎn)量的提高有很大的影響。非離子表面活性劑可以增加細胞膜的通透性［3］，減少氧及營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞的傳遞阻力，還可以使胞內(nèi)的目標產(chǎn)物釋放到胞外，可減少由于產(chǎn)物積累而造成的產(chǎn)物反饋抑制［4］。因此本文在搖瓶條件下研究了非離子表面活性劑對泰樂菌素細胞生長和泰樂菌素效價及A組分轉(zhuǎn)化的影響，以確定泰樂菌素發(fā)酵過程中最佳非離子表面活性劑Tween-20的添加時間和添加量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 紫外可見分光光度計（T6新世紀），北京普析通用儀器有限責任公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-30KBS），上海申安醫(yī)療器械廠；高效液相色譜儀（LC20AG），日本島津公司。

1.1.2 主要試劑 PEG 600，化學純，Tween-20、L-Met，分析純，均購自天津大茂化學試劑廠；乙腈、甲醇，色譜純，美國Fisher科技公司。

1.1.3 供試菌株 泰樂菌素產(chǎn)生菌TLG13-48，由本公司提供。

1.1.4 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：豆餅粉、玉米漿為本地農(nóng)副產(chǎn)品，酵母膏購自北京奧博星試劑公司，碳酸鈣購自甘肅天玉化工廠。裝量30 mL／250 mL，三角瓶。

發(fā)酵培養(yǎng)基：棉籽餅粉購自甘肅禾麟，玉米蛋白粉、玉米粉為當?shù)剞r(nóng)副產(chǎn)品，碳酸鈣購自甘肅天玉化工廠，鹽酸甜菜堿、磷酸氫二氨、氯化鈉、氯化鉀都為分析純試劑。裝量35 mL／250 mL，三角瓶。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 菌株活化：制備數(shù)支斜面，室溫放置2 d，使斜面表面干燥。取斜面保藏的供試菌株一支，用玻璃棒蘸取孢子，均勻的涂布到已制備好的斜面上，29℃培養(yǎng)8 d，供后續(xù)實驗所用。種子制備：取新鮮斜面一支，用接種鏟接種于種子培養(yǎng)基中，在28℃，200 r／min的條件下培養(yǎng)46 h。發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液接種于發(fā)酵搖瓶中，28 ℃，200 r／min 培養(yǎng)160 h。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 泰樂菌素標準曲線繪制［5］精密稱取適量的泰樂菌素標準品，用純化水稀釋制得1000 U／mL的溶液，分別用純化水稀釋成 700、600、500、400、300 U／mL的標準液，各吸取1 mL加入25 mL的容量瓶，用 0.1 mol／L鹽酸定容，搖勻后靜置。以0.1 mol／L鹽酸做空白對照試驗，用分光光度計在290 nm處測量吸光值，以該標準液的濃度為縱坐標，吸光值為橫坐標，繪制標準曲線（圖1）。

圖1 泰樂菌素標準曲線

泰樂菌素濃度在吸光值為0.3～0.7的范圍內(nèi)線性相關(guān)，對數(shù)據(jù)進行線性回歸，得到方程：y＝41.715x+0.3159 （R2＝ 0.9949） 。

1.2.2.2 泰樂菌素效價測定［6］取發(fā)酵液5 mL，加入20%硫酸鋁溶液1.5 mL，攪拌，過濾，根據(jù)估計效價稀釋至可檢測范圍，吸取稀釋過的溶液1 mL至25 mL容量瓶中，加0.1 mol／L的鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，以0.1 mol／L的鹽酸溶液做空白對照，用分光光度計在290 nm處測量吸光值，查標準曲線相對應(yīng)的數(shù)據(jù)乘以稀釋倍數(shù)即可。

1.2.2.3 泰樂菌素組分測定［7］HPLC色譜條件：色譜柱 C18 柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動相0.85 mol／L高氯酸鈉溶液-乙腈（18 ∶13）；檢測波長 290 nm；流速 1 mL／min；進樣量 10 μL。 用HPLC測定、計算萃取分離過程中溶劑相與水相中的各組分純度與含量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的PEG 600對泰樂菌素效價和組分A的影響

2.1.1 搖瓶發(fā)酵0 h時添加不同濃度的PEG 600對泰樂菌素效價和組分A的影響 以不添加表面活性劑為對照，不同濃度的PEG 600對泰樂菌素效價及組分的影響結(jié)果見表1。

表1 搖瓶發(fā)酵0 h添加不同濃度的PEG 600后泰樂菌素的效價和組分

由表1可知，搖瓶發(fā)酵0 h時添加3.0%的PEG 600，效價提高幅度最大，比對照提高了11.7%。添加濃度為3.5%的PEG 600，其效價與對照基本一致，但組分A提高幅度最大，比對照提高了9.0%。

2.1.2 搖瓶發(fā)酵50 h時添加不同濃度的PEG 600對泰樂菌素效價和組分A的影響 發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)至50 h時，添加不同濃度的PEG 600 2 mL，終濃度分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%，以不添加表面活性劑為對照，對泰樂菌素效價及組分的影響結(jié)果見表2。

表2 搖瓶發(fā)酵50 h時添加不同濃度的PEG 600后泰樂菌素的效價和組分

由表2可知，發(fā)酵培養(yǎng)50 h時添加不同濃度的PEG 600，效價均有提高，添加濃度為4.0%的PEG 600，效價提高幅度最大，比對照提高了20.8%。組分A的含量比對照均降低，添加濃度為4.0%的PEG 600，組分A下降幅度最大，比對照降低了27%。

2.2 搖瓶發(fā)酵50 h時添加不同濃度的L-Met對泰樂菌素效價和組分A的影響 發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)至50 h時，添加不同濃度的L-Met 2 mL，終濃度分別為0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%，以不添加表面活性劑L-Met為對照，對泰樂菌素效價及組分的影響結(jié)果見表3。

表3 搖瓶發(fā)酵50 h時添加不同濃度L-Met后泰樂菌素的效價及組分

由表3可知，發(fā)酵培養(yǎng)50 h時添加不同濃度的L-Met，隨著L-Met濃度的增大，效價降低，組分A增高。只有0.01%的L-Met能夠提高效價，比對照提高了2.3%，但組分A比對照降低了6.5%。

2.3 搖瓶發(fā)酵50 h時添加不同濃度的Tween-20對泰樂菌素效價和組分A的影響 發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)至50 h時，添加不同濃度的Tween-20 2 mL，終濃度分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，以不添加表面活性劑Tween-20為對照，對泰樂菌素效價及組分的影響結(jié)果見表4。

表4 搖瓶發(fā)酵50 h時添加不同濃度的Tween-20后泰樂菌的效價和組分

由表4可知，發(fā)酵培養(yǎng)50 h時添加不同濃度的Tween-20，效價均比對照有所提高，其中添加濃度為3.5%時，效價提高幅度最大，比對照提高了53.5%，但組分A的含量比對照均降低，添加濃度為3.5%時，組分A下降最大，比對照下降了42.7%。

3 討論與小結(jié)

非離子表面活性劑可以改變氣-液、液-液及液-固界面性質(zhì)，使其具有起泡、消泡、乳化、分散、滲透、助溶等多方面的性能，因此非離子表面活性劑廣泛應(yīng)用于人類活動的各個領(lǐng)域，從化妝品調(diào)和、食品與飼料加工、皮革制品加工、化學纖維加工、紡織品印染及整理、醫(yī)藥的加工、礦物浮選、石油開采、油品處理、工業(yè)洗滌等各個工業(yè)部門，被譽為“最高效的工業(yè)味精”。

本實驗在泰樂菌素發(fā)酵中添加非離子型的表面活性劑 PEG 600、Tween-20、L-Met，結(jié)果表明 PEG 600、Tween-20兩種非離子表面活性劑均能促進泰樂菌素效價的提高，但對泰樂菌素組分A的轉(zhuǎn)化有抑制作用；L-Met對泰樂菌素產(chǎn)效價能力有抑制作用，但對泰樂菌素A的轉(zhuǎn)化有促進作用，可以促進大菌素C向泰樂菌素A的轉(zhuǎn)化。因此，在泰樂菌素發(fā)酵中添加非離子型表面活性劑主要可以對菌體細胞膜的通透性進行調(diào)控，以利于營養(yǎng)物質(zhì)的進入或代謝產(chǎn)物的釋放，從而達到提高產(chǎn)量的目的。

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