彭銳綜述，張洪審校（武漢大學人民醫(yī)院藥學部，武漢 430060）

我國是乙型肝炎病毒（HBV）感染的大國，據研究表明全球有3.5億HBV 攜帶者，我國占三分之一，每年發(fā)病率達6000萬人次以上。不同HBV DNA 基因型之間存在著致病性的差異，因此，HBV 基因分型對快速了解患者感染病毒狀況具有十分重要的作用。HBV 屬于嗜肝DNA 病毒科，部分雙鏈環(huán)形DNA 病毒，基因組長約3.2kb，基因組中包含4個開放區(qū)：前S／S、前C／C、X和P區(qū)［1］。由于缺乏校對功能的酶，HBVDNA復制過程容易發(fā)生堿基錯配，從而發(fā)生基因突變形成不同基因型。

1 HBV 基因多態(tài)性

1.1 地域分布目前根據全基因序列異質性大于或等于8%，將HBV 基因型分為A～J 10種不同類型，并且每種基因型分布存在地域差異現(xiàn)象［2］?；蛐虯 包含A1～A7七種亞型；B型有B1～B9九種亞型；基因型C有12種亞型C1～C12；D型有8種亞型D1～D8；基因型F 只有4種亞型F1～F4；其他基因型目前還未發(fā)現(xiàn)亞型存在。有關HBV 基因型研究表明，B和C 基因型主要分布在亞洲；而歐洲最常見的基因型是A 和D型［3］。雷延昌等［4］研究湖北省190例HBV DNA 陽性血清標本研究發(fā)現(xiàn)，B基因型140例（73.7%），C 基因型42例（22.1%），BC混合型8例（4.2%），未發(fā)現(xiàn)A、D 和E 基因型；新疆地區(qū)B型占5.56%，C 基因型也占據5.56%，BC 雜合型有22.22%，而D 基因型高達66.67%。說明HBV 基因型在我國的地域分布存在明顯差異，見表1。

1.2 HBV 基因型與肝病演化的關系研究表明基因B型通常引發(fā)輕微肝纖維化；C型易引起侵害性的嚴重肝臟疾病，可發(fā)展為肝硬化和肝癌；A 基因型攜帶者比D 基因型更易發(fā)展為慢性肝炎，D 基因容易誘導急性肝炎［5］。因此，臨床治療前HBV DNA 基因型檢測具有十分重要的作用，對臨床抗病毒治療方法的選擇、預后判斷都有指導意義。

1.3 慢性乙型肝炎（CHB）CHB表現(xiàn)出明顯的地域分布多態(tài)性，在亞洲和非洲發(fā)病概率較高，而在北美和歐洲發(fā)病概率相對較低。目前，世界上超過3.5億人是HBV 慢性感染者，60%肝癌患者通過CHB 演化而來。CHB 感染者乙型肝炎表面抗原（HBsAg）比健康個體含量高1.5%。HBV 存在多種傳播途徑，包括輸血、子宮內、性關系、家族之間和醫(yī)院內傳播等［6］。HBV 感染后的臨床治療結果高度可變，遺傳和環(huán)境因素對肝臟疾病的進展起著重要的調節(jié)作用。人口統(tǒng)計學變量闡述了感染者的年齡、性別、生活習慣、伴隨疾?。ㄈ缏跃凭膊　⑵渌尾《靖腥镜龋┒紩绊慔BV持續(xù)性感染［7－9］。CHB會發(fā)展為其他肝臟疾病，像肝纖維化、肝硬化和肝癌等，緊密依賴于與疾病相關基因型。

表1 中國部分省份HBV 基因型分布差異

1.4 HBV 基因型對藥物使用的影響 HBV 基因突變會產生病毒耐藥現(xiàn)象，比如：拉米呋定是抗HBV 治療的一線藥物，耐藥的主要機制是HBV－DNA 聚合酶基因突變引發(fā)病毒DNA與藥物的結合力減弱，主要是rtL180M＋rtM204V 和rtM204I突變。另外一個研究說明，阿德福韋耐藥菌株的位點是rtN236Tand rtA181［10］。HBV 基因C型患者比B型基因突變更易產生耐藥性，但是其機制并沒有完全闡明。可能是由于不同HBV 基因型結構差異編碼出不同蛋白質，以至于對拉米呋定產生了不同耐藥反應。另一原因也許是在服用拉米呋定后，基因C型相對基因D型更容易出現(xiàn)YMDD 突變［11］。所以更應注意對基因C型乙型肝炎患者的關注，無論在抗病毒治療過程還是對常見耐藥位點的監(jiān)測。對長期服用核苷酸類似藥物的患者，對耐藥突變和基因檢測顯得尤為重要，有助于了解不同基因型乙型肝炎患者相關耐藥基因，幫助選擇抗病毒藥物、對個體化抗病毒治療提供科學依據［12］。HBV 基因型差異對干擾素的反應也存在區(qū)別，干擾素對基因B型和C型的患者治療效果更好；基因D型比混合基因型有更好的治療效果。主要是因為HBV 基因C 區(qū)啟動子C 遺傳變異的分子特征決定。攜帶基因A型患者對干擾素治療效果較好，因為HBV 基因C區(qū)容易發(fā)生啟動子突變和更少核衣殼蛋白變異。而且前C區(qū)終止密碼子突變會導致干擾素療效的下降。

2 HBV－DNA 基因型檢測

HBV 耐藥基因突變和基因型檢測對指導臨床治療具有潛在價值，尋找一種適合臨床檢測的方法非常必要。研究表明，近年來許多方法用于檢測HBV 耐藥基因和進行基因分型。比如基于測序的方法［克隆測序和聚合酶鏈反應（PCR）產物直接測序］；限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）［13－14］；PCR 特異性引物測序；基于雜交的方法［寡核苷酸芯片、INNO－LiPA 分型和PCR 微型板塊雜交－酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術］等。

2.1 PCR 產物直接測序方法此方法主要包括HBV－DNA全基因測序和S基因測序，直接測序方法是目前臨床上最常見的檢測方法，通過測序來檢測病毒基因型和直觀的變異，是HBV 基因型檢測的金標準，但是存在許多缺陷，如操作繁瑣、耗時、高成本和較難改進等，而且只能檢測出突變大于或等于20%的基因型。有關研究說明，S基因測序與全基因測序有著同樣的準確性，HBV－NA S基因區(qū)由S基因、前S1基因和前S2基因組成，它們能夠分別編碼HBsAg的小蛋白、大蛋白和中間蛋白。但是S基因測序也是種昂貴、耗勞動力的方法，不適合大范圍臨床和流行病學研究工作。

2.2 PCR－RFLP 此方法是結合PCR 技術和RFLP技術，使來源于PCR 擴增的目的片段在合適的限制性內切酶水解作用后，通過瓊脂糖凝膠電泳，不同的基因型片段呈現(xiàn)出不同長度的條帶［15］，從而加以區(qū)分，是臨床上一種有效的檢測方法。

2.3 INNO－LiPA 分型和寡核苷酸芯片法

2.3.1 INNO－LiPA 分型作用原理為生物素標記的HBVDNA 擴增產物與以平行方式固定在尼龍膜上的寡核苷酸探針雜交，未雜交的DNA 被沖洗掉；然后，加入的堿性磷酸酶標記的鏈霉菌親和素與生物素標記的雜交產物結合；最后，將BCIP／NBT 加入到尼龍膜上觀察顏色的變化。

2.3.2 寡核苷酸芯片法此法是基于反相雜交的原理，使Cy5標記的擴增子與固定在微板上的特異性類型寡核苷酸雜交。

2.4 PCR 微型板塊雜交－ELISA技術PCR提取血清樣品中HBV－DNA，然后與兩個特異性探針雜交。其中一個探針用于捕獲HBV－DNA，另一種是5′端生物素標記的基因分型探針。此技術靈敏性和特異性和S基因直接測序法相同，可適用于大范圍的臨床檢測和流行病學研究。

2.5 微陣列它是基于雜交的一種方法，能同時檢測多個樣品。但是其靈敏性并不高，因此相關研究通過增強信號的方法解決此問題。采用兩種信號增強的辦法來增加微陣列DNA的熒光信號強度，即多標記側鏈引物和多檢測點引物。前種方法是同時增加特異性擴增的靶標產物熒光標記分子的數(shù)量；后者是增加每個雜交位置可檢測的熒光分子。

2.6 HiSeq測序上述方法在操作過程都存在各種缺陷，因此Han等［16］改進成新技術HiSeq測序。此測序首先將經過剪切的DNA 片段兩端加上接頭并通過堿基互補結合固定在芯片表面，使用引物擴增后將雙鏈變性為單鏈后該單鏈的一端就固定在芯片上，另一游離端可隨機與附近另外一個引物互補結合，也被固定形成一個橋。用引物PCR 后每個DNA 片段大約獲得1000倍擴增，形成單克隆的DNA 簇群。HiSeq測序對HBV 基因型的檢測有較高的靈敏性、精確性、高通量和自動化，是檢測HBV DNA 基因突變和分型的好方法。橋式PCR的設計采用一個引物連接標記序列的末端。在PCR 循環(huán)反應中，橋式引物將標記片段串聯(lián)起來，是一種能高通量的將標記序列進行簡單、有效的擴增。

3 結論

HBV 基因型呈現(xiàn)出明顯的域分布差異，研究不同基因型間的不同致病性對疾病演進、傳播方法和抗病毒的治療有著重要的意義。即使現(xiàn)在HBV－DNA 檢測技術和分型方法得到了改進，但是一種更適合大樣本基因型分析和低成本、低耗時的方法還有待探索。希望通過不斷探索，將這些成果運用到HBV 預防、治療和乙型肝炎患者臨床類型檢測，實現(xiàn)真正的個體化用藥。

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