吳艾霖，熊怡淞，王艷艷，曲遠青，段小剛，吳麗娟（成都軍區(qū)總醫(yī)院臨床實驗醫(yī)學研究與保障中心，成都 610083）

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性流行，但不同地區(qū)HBV 感染的具體情況差異很大。據(jù)相關(guān)研究報道顯示，我國有1億以上的HBV 感染或攜帶者［1－2］。乙型肝炎的實驗室檢測主要有血清學、病毒學、生物化學試驗等，有效治療策略也主要集中于藥物抗病毒治療，并將乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）血清學轉(zhuǎn)陰作為停藥的指標。但近年來臨床觀察發(fā)現(xiàn)，HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰患者停藥后，也有較高的復發(fā)率，所以將血清學轉(zhuǎn)陰作為停藥的指標并不恰當［3－4］。HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰的原因較為復雜，主要涉及患者自身免疫功能缺陷或轉(zhuǎn)換、病毒自身原因等，但由于患者自身的因素較為復雜且個體差異較大［5］。所以本研究擬從病毒自身原因的角度探討HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰、HBV 基因型和YMDD 變異位點3者的相關(guān)性，為制定HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰的乙型肝炎患者的檢測策略提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取本院2010年1月至2012年12月就診的1200例乙型肝炎患者作為研究對象，其中男798例，女402例；年齡5～76歲，平均39.2歲。所有患者HBeAg血清學檢查轉(zhuǎn)陰577例，623例HBeAg 血清學檢查未轉(zhuǎn)陰；排除合并甲、丙、戊、庚肝及自身免疫性肝炎患者。

1.2 儀器與試劑 CFX96實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀、電泳儀、凝膠成像儀均購于美國Bio－Rad 公司；ABI3130／3130XL DNA 測序儀購于美國ABI公司；HBV YMDD 基因突變診斷試劑購于上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司；HBV 基因分型和變異位點檢測試劑購于北京鑫諾美迪有限公司；探針引物、TaqDNA聚合酶、DNA提取液、DNA濃縮液、DNA去離子水等均使用北京鑫諾美迪有限公司提供的試劑盒內(nèi)的原裝試劑。

1.3 方法1200例乙型肝炎患者均行乙型肝炎5項、乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV－DNA）、乙型肝炎病毒A、B、C、D分型、YMDD 基因突變位點等檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測乙型肝炎5項，PCR 定量HBV－DNA，線性探針反向雜交法進行HBV 基因分型，各項檢測均完全按照相應(yīng)試劑盒說明書嚴格執(zhí)行。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理及統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；以α＝0.05為檢驗水準，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV－DNA 病毒定量檢測對1200例確診為乙型肝炎的患者進行PCR 檢測，577份HBeAg 血清學轉(zhuǎn)陰標本中，HBV－DNA≥103copy／mL標本共計233例，占40.38%；HBV－DNA＜103copy／mL標本共計344份，占59.62%。623份HBeAg血清學未轉(zhuǎn)陰標本中，HBV－DNA≥103copy／mL的標本共計508例，占81.54%；HBV－DNA＜103copy／mL 標本共計115份，占18.46%。

2.2 HBV－DNA 陽性的HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰患者和未轉(zhuǎn)陰患者的基因型分布檢測對233例HBV－DNA≥103copy／mL的HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰患者標本進行乙型肝炎病毒基因型檢測，分型結(jié)果顯示A、B、C、D 基因型所占比例依次為69.96%（163／233）、24.46%（57／233）、4.72%（11／233）、0.86%（2／233）；對未發(fā)生HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰，且HBV－DNA≥103copy／mL的508例患者基因分型檢測，A、B、C、D 基因型所占比例依次為57.48%（292／508）、36.22%（184／508）、5.71%（29／508）、0.59%（3／508）。HBV－DNA 陽性的HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰患者和未轉(zhuǎn)陰患者在A、B、C、D 基因型分布上比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 HBV－DNA 陽性的HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰患者和未轉(zhuǎn)陰患者的YMDD 突變率檢測對HBV－DNA≥103copy／mL 的HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰患者233例和未轉(zhuǎn)陰的508例患者的病歷資料進行分析發(fā)現(xiàn)，所有患者均有拉米夫定6個月以上的服用史。YMDD 基因變異檢測共發(fā)現(xiàn)YMDD 變異133例，其中HBV－DNA≥103copy／mL、HBeAg 血清轉(zhuǎn)陰患者106例，占HBV－DNA陽性且血清學轉(zhuǎn)陰患者的45.49%（106／233）；HBV－DNA≥103copy／mL、HBeAg血清未轉(zhuǎn)陰患者27例，占DNA 陽性且血清學未轉(zhuǎn)陰患者的5.31%（27／508），兩組基因突變率比較，前者明顯高于后者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰與未轉(zhuǎn)陰患者的YMDD 突變情況

2.4 HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰與YMDD 突變、HBV 基因型之間的相關(guān)性分析乙型肝炎患者的YMDD 突變型多為B型和C型，明顯高于A型和D型，突變位點多為V 突變。見表2。

表2 HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰與YMDD 突變、HBV 基因型的相關(guān)性（n）

3 討論

長期以來人們普遍認為“小三陽”比“大三陽”輕，甚至更有人認為“小三陽”無需治療。然而，越來越多的研究表明這種觀點是不科學的［6－7］。本研究證實不少乙型肝炎患者經(jīng)拉米夫定治療一段時間后，雖然乙型肝炎病毒e抗原已轉(zhuǎn)陰，即成為“小三陽”，但其HBV－DNA 拷貝數(shù)仍然大于或等于103，即仍然有病毒復制。倘若此時沒有繼續(xù)檢測病毒復制的情況，僅以HBeAg轉(zhuǎn)陰為停藥指標，則患者病情復發(fā)迅速且復發(fā)率高，甚至出現(xiàn)病情加重或耐藥現(xiàn)象，后期治療難度較大。

抗病毒治療是慢性HBV 感染的一項基本治療措施。核苷酸類似物拉米夫定作用于HBV 多聚酶活性部位YMDD 基因序列，從而抑制HBV－DNA 復制，抗病毒效果明顯［8－10］。但臨床上部分患者可表現(xiàn)為無應(yīng)答或隨著用藥時間的延長，HBV 發(fā)生突變并導致對拉米夫定耐藥，影響拉米夫定的療效。本研究通過使用YMDD 診斷試劑盒，對收集的1200份乙型肝炎患者血清標本檢測基因突變位點，結(jié)果表明HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰的患者仍然存在基因位點變異，并且這部分患者的突變率明顯高于HBeAg 血清學未轉(zhuǎn)陰的患者。因此，筆者分析HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰，可能只是因為YMDD 位點發(fā)生了突變，實際上其病毒仍然處于不斷復制中。楊彥麟等［11］對HBeAg陽性患者中HBV 基因型分布及YMDD 變異位點的分析，顯示HBeAg陽性患者的基因型突變率達到35.34%，但筆者的研究發(fā)現(xiàn)HBeAg陰性患者的基因型也會發(fā)生突變，并且突變率高達45.49%。因此，對HBeAg陰性患者不能放松警惕，應(yīng)持續(xù)或定期監(jiān)測HBV－DNA 拷貝數(shù)。

本研究結(jié)果顯示，乙型肝炎患者的YMDD 突變型多為B型和C型，明顯高于A型和D型，突變位點多為V型，這與相關(guān)研究結(jié)果一致［11］。說明長期服用拉米夫定易使患者發(fā)生YMDD 突變，尤其是B型和C型的突變，從而出現(xiàn)HBV 對拉米夫定耐藥，進而在臨床檢查上出現(xiàn)HBeAg陰性，但乙型肝炎病毒拷貝數(shù)仍走高的情況，不利于患者后期的抗病毒治療。本研究提示HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰、HBV 基因型、YMDD 基因突變3者具有一定的關(guān)聯(lián)，在臨床抗病毒治療上不能只考慮其中1個因素，而應(yīng)該綜合考慮以上因素，優(yōu)化乙型肝炎抗病毒治療方案，達到最佳效果。

綜上所述，乙型肝炎患者的HBeAg血清學轉(zhuǎn)陰、HBV 基因型、YMDD 基因突變3者具有一定的關(guān)聯(lián)，應(yīng)予以密切關(guān)注。

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