徐 程，豐 蕾，楊 帆，涂 政，胡 蘭#

(1中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100038;2公安部物證鑒定中心，法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;*通訊作者，E-mail:fengleink@163.com;#共同通訊作者，E-mail:hulan328@yahoo.com)

目前，要求對微量生物檢材進(jìn)行DNA檢驗(yàn)的案件數(shù)量呈上升趨勢，這些檢材在很多情況下是案件的唯一物證。因此，如何高效地對微量檢材進(jìn)行DNA檢驗(yàn)，成功獲得正確的STR分型，成為法醫(yī)學(xué)工作面臨的難題［1］。

從微量檢材(如滲透性載體上的指紋)獲得足夠濃度的高質(zhì)量DNA，是成功進(jìn)行STR分型的前提。通常，對微量、疑難生物檢材的檢驗(yàn)，多采用磁珠法如M48純化試劑盒［2］等盡可能多地提取DNA。Vandewoestyne等［3］采用Amicon離心超濾管對各種微量DNA進(jìn)行濃縮純化，對于Chelex提取的DNA純化效果明顯。然而，盡管經(jīng)過前期純化，部分檢材仍無法獲得可靠的STR分型。對M48純化試劑盒提取后的DNA體積(30μl)較小，Amicon離心超濾管也無法用于DNA的濃縮。本研究通過對已經(jīng)過純化后的微量DNA進(jìn)行進(jìn)一步純化、濃縮，提高了疑難微量檢材(白紙上的汗?jié)撝讣y)DNA的檢出率，成功獲得樣本STR的準(zhǔn)確分型。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

①分別采集3名健康志愿者的口腔拭子(a)，血液(b)，精斑(c)。常溫晾干備用。②三名志愿者手指(未洗手)在白紙上按壓10 s，采集汗?jié)撝讣y24枚。

1.2 主要試劑和儀器

M48純化試劑盒(Qiagen公司，德國);Amicon離心超濾管(Millipore公司，美國);DNA Clean＆ConcentratorTM－5試劑盒(ZYMO RESEARCH公司，美國);Identifier?試劑盒(AB公司，美國);高速臺式離心機(jī)(Thermo，美國);NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo，美國);9700型PCR擴(kuò)增儀(AB公司，美國);ABI3130XL遺傳分析儀(AB公司，美國)。

1.3 DNA提取及樣本的制備

將檢材 a，b，c用 M48純化試劑盒(Qiagen，德國)，參考使用手冊，提取DNA樣本。

將Identifier?試劑盒AmpFLSTR Control DNA 9947A(AB公司，美國)以及M48純化試劑盒提取的DNA樣本，采用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo，美國)按照操作手冊，對DNA的濃度進(jìn)行定量。

參考定量結(jié)果，分別稀釋9947A、口腔DNA、血液DNA和精斑DNA，經(jīng)計(jì)算終濃度約為20 pg/μl。

1.4 模板DNA的純化與濃縮

1.4.1 DNA Clean ＆ ConcentratorTM－5試劑盒純化 將稀釋后的DNA樣品各吸取30μl(模擬M48提取后，回收DNA常規(guī)體積)，采用DNA Clean＆ConcentratorTM－5試劑盒(ZYMO RESEARCH公司，美國)，在DNA中加入60μl(2∶1)結(jié)合液，經(jīng)過純化柱13 000 r/min離心30s，加入200μl洗滌液13 000 r/min離心30 s，重復(fù)一次。最后將過濾管放入新的EP管中，在過濾膜中心加入6μl超純水(65℃)，孵育1 min，13 000 r/min離心30s回收 DNA。回收后的DNA總體積為6μl，每個(gè)樣本重復(fù)檢驗(yàn)10次。

1.4.2 Amicon離心超濾管純化 將稀釋后的DNA樣品各吸取30μl(模擬M48提取后，回收DNA常規(guī)體積)，加入Amicon離心超濾管(Millipore公司，美國)內(nèi)管，13 000 r/min離心10 min，再將過濾管取出倒置放入新的EP管中，1 000 r/min離心3 min回收DNA，回收后的DNA總體積為20μl，每個(gè)樣本重復(fù)檢驗(yàn)5次。

1.5 擴(kuò)增及電泳

將稀釋前的DNA模板，以及經(jīng)過稀釋后分別選用兩種方法純化的DNA樣本，在9700型PCR擴(kuò)增儀(AB公司，美國)上，應(yīng)用Identifier試劑盒(AB公司，美國)擴(kuò)增。體系為:PCR Reaction Mix 4.2 μl，Primer Mix 2.2 μl，AmpliTaq Gold DNA Polymerase:0.2 μl，H2O 3.3 μl。擴(kuò)增條件為:95℃ 11 min→(94℃ 1 min→59℃ 1 min→72℃1 min)×28個(gè)循環(huán)→60℃ 60 min→4℃保存?zhèn)溆?。AmpFLSTR Control DNA 9947為陽性對照，選取純水作為陰性對照。

DNA擴(kuò)增產(chǎn)物1μl，加入10μl loading buffer(高純度去離子甲酰胺和LIZTM－500內(nèi)標(biāo)的混合物，混合比例為50∶1)中，然后在3130XL遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.6 指紋DNA檢驗(yàn)

分別剪取24枚含有指紋的白紙，用M48純化試劑盒(Qiagen，德國)提取DNA樣本，按照1.5所述對樣本進(jìn)行擴(kuò)增及電泳。

吸取30μl M48提取后的指紋DNA，采用DNA Clean＆ConcentratorTM－5試劑盒純化提取后的DNA，按照1.5所述對樣本進(jìn)行擴(kuò)增及電泳。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Genemapper ID X軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢測熒光強(qiáng)度RFU(Relative Fluorescence Units)閾值設(shè)為50。稀釋前的DNA樣品的STR分型結(jié)果為已知分型結(jié)果。將純化后STR分型圖譜與已知分型結(jié)果進(jìn)行比對，其中以獲得9個(gè)以上基因座的明確分型為有效分型。所有數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS 20軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行Fisher確切概率檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 純化前STR分型圖譜Figure 1 STR profile before purification

圖2 Amicon純化后STR圖譜分型及峰面積Figure 2 STR profile and peak area after purified by Amicon Utral

圖3 DNA Clean＆Concentrator TM－5試劑盒純化后STR圖譜分型及峰面積Figure 3 STR profile and peak area after purified by DNA Clean＆Concentrator TM－5 kit

2 結(jié)果

2.1 稀釋后DNA的分型結(jié)果

比較兩種方法純化后STR分型圖譜每個(gè)基因座上等位基因的峰高、峰面積及等位基因丟失率的結(jié)果顯示:經(jīng)過Amicon超濾離心管濃縮后，獲得的DNA體積約為20μl，濃縮倍數(shù)約為1.5倍(見表1);經(jīng)過STR分型，平均峰高為85.3RFU，平均峰面積為1 130.8，等位基因丟失率為66.13%。而采用DNA Clean＆ConcentratorTM－5試劑盒對樣本DNA進(jìn)行濃縮后，獲得DNA體積為6μl，體積濃縮倍數(shù)為5倍。經(jīng)過電泳分析，樣本的平均峰高為147.5 RFU，平均峰面積為1 960.2，等位基因丟失率為35.14%。

表1 兩種濃縮方法濃縮效果的比較Table 1 Comparison of concentrated effects between two methods

將STR分型圖譜與已知分型結(jié)果進(jìn)行比對，其中以獲得9個(gè)以上基因座的明確分型為有效分型。Amicon超濾離心管對微量DNA的純化后檢驗(yàn)效果低于DNA Clean＆ConcentratorTM－5試劑盒，結(jié)果見表2。

表2 Amicon超濾離心管，DNA Clean＆Concentrator TM－5試劑盒STR檢測結(jié)果Table 2 The STR detection results by Amicon Ultra and DNA Clean＆Concentrator TM－5 kit

經(jīng)過M48試劑盒提取后稀釋的DNA，未經(jīng)過濃縮直接擴(kuò)增檢驗(yàn)，無法獲得明確的STR分型結(jié)果，分型圖譜見圖1(見第551頁)。將提取后的30μl DNA經(jīng)過Amicon試劑盒濃縮后，僅獲得個(gè)別位點(diǎn)的STR分型，且峰高較低，分型結(jié)果不利于判斷(圖2，見第551頁);經(jīng)過DNA Clean＆ConcentratorTM－5試劑盒濃縮后，可以獲得完整的STR分型圖譜，并且與稀釋前DNA分型一致(圖3，見第552頁)。

2.2 汗?jié)撝讣y的檢驗(yàn)結(jié)果

汗?jié)撝讣yM48提取的DNA，采用DNA Clean＆ConcentratorTM－5試劑盒純化濃縮，結(jié)果顯示，可以提高接觸DNA的檢出率(見表3)。

3 討論

表3 汗?jié)撝讣ySTR分型DNA Clean＆Concentrator TM－5純化前后檢驗(yàn)結(jié)果Table3 The STR results of fingerprints before and after concentrated by DNA Clean＆Concentrator TM－5 kit

根據(jù)Peter Gill對于低模板DNA的定義，模板量低于100 pg的樣本被稱為微量DNA［4］。針對接觸檢材等微量檢材的檢驗(yàn)，通常通過以下多種方法來提高檢驗(yàn)的成功率。①DNA提取可以選用磁珠法代替Chelex100法提高DNA提取量［5］;②可以通過純化試劑盒對提取的DNA進(jìn)行進(jìn)一步的純化［3］;③在進(jìn)行DNA擴(kuò)增時(shí)，通過縮小PCR擴(kuò)增體系的總體積或者適當(dāng)增加循環(huán)次數(shù)［6，7］也能提高檢驗(yàn)成功率。然而，盡管有上述的多種方法，實(shí)際案件中仍不乏有經(jīng)過上述處理后，仍然無法得到正確STR分型的例子。

參考Identifiler?Kit的使用手冊，建議進(jìn)行擴(kuò)增前，應(yīng)該對模板DNA進(jìn)行定量，擴(kuò)增體系中加入反應(yīng)的模板量范圍為0.5－1.25 ng。低于該檢測下限的DNA檢測效果不佳。本實(shí)驗(yàn)將樣本DNA的濃度稀釋到試劑盒的檢測下限以下，通過計(jì)算濃度約為20 pg/μl。通過增加模板DNA輸入體積、增加循環(huán)參數(shù)等方法，均難以得到有效的STR分型圖譜。

目前，對DNA進(jìn)行純化有許多不同的方法。M48純化試劑盒對模板DNA進(jìn)行純化的基本原理是磁珠法，利用順磁性顆粒(PMP)在高鹽離子存在下結(jié)合核酸，低滲下釋放核酸的原理，在磁場作用下，將磁性顆粒與液體分開，提取純化DNA樣品。Amicon離心超濾管采用的是復(fù)合再生纖維素超濾膜，利用超濾膜不同孔徑的微孔，將比其孔徑小的分子，如水等濾過掉［8，9］，從而在內(nèi)管中獲得濃縮、純化后的樣品DNA。Amicon已經(jīng)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)中，對微量 DNA、游離 DNA進(jìn)行純化。Vandewoestyne等［3］針對 Chelex－100 提取后的游離 DNA，采用Amicon超濾管對500μl的DNA進(jìn)行濃縮。但是對于體積較小的樣本，不適合選用該方法進(jìn)行純化。根據(jù)使用手冊，Amicon超濾管對模板DNA濃縮后，回收體積為20μl。通常，M48純化后回收的DNA體積為30μl，采用Amicon進(jìn)一步純化僅能濃縮1.5倍，其效果不明顯。

DNA Clean＆ConcentratorTM－5試劑盒可以將低體積的DNA，在DNA Binding Buffer的作用下，與純化管內(nèi)膜進(jìn)行高效特異性結(jié)合。通過洗滌，可以有效去除各類酶、熒光染料、游離dNTP等雜質(zhì)。隨后利用DNA的親水性回收DNA。DNA回收體積為6μl，將樣本濃縮5倍以上，DNA回收率根據(jù)片斷大小不同，10 kb以下DNA回收率可達(dá)90%，而超過11 kb的大片斷DNA回收率可達(dá)70%。已有研究采用DNA Clean＆ConcentratorTM－5試劑盒應(yīng)用于對PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA的純化［10］，也有研究將該試劑盒應(yīng)用于表觀遺傳學(xué)的DNA回收［11］。但是，目前該試劑盒尚未應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)中。本實(shí)驗(yàn)可將DNA樣本的濃度濃縮到 0.1 ng/μl，明顯提高了PCR擴(kuò)增的模板DNA量。通過汗?jié)撝讣y的檢驗(yàn)，可以得出，針對接觸DNA的檢驗(yàn)，對DNA進(jìn)行濃縮可以有效提高STR分型的檢出率，為案件的偵破提供一定信息。

DNA Clean＆ConcentratorTM－5試劑盒操作簡便、省時(shí)，通過DNA結(jié)合、洗滌、回收三個(gè)步驟，可以在3 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對樣本的濃縮回收，比Amicon濃縮需要的時(shí)間縮短了5倍，而濃縮的效果卻明顯高于Amicon法。其價(jià)格便宜，更適合于在基層推廣應(yīng)用。由此可見，DNA Clean＆ConcentratorTM－5試劑盒對于純化后微量DNA的濃縮回收，在法醫(yī)學(xué)中可以作為純化后DNA的補(bǔ)充檢驗(yàn)手段，來提高檢出率。

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