尉春艷，彭慧霞，張 熙，孫學(xué)軍，張 菊，高艷娥

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安710004;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科;3西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科;4第四軍醫(yī)大學(xué)基因診斷技術(shù)研究所;*通訊作者，E-mail:weichy1023@163.com)

宮頸癌(cervical cancer)是女性生殖系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國(guó)家的婦女癌癥死因中占88%［1］。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)與宮頸癌的關(guān)系越來(lái)越明確［2］，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)于1996年確認(rèn)HPV是宮頸癌的主要病因。但是HPV感染并不是宮頸癌的唯一致病原因，70%以上的HPV感染具有一過(guò)性，病毒可在6－8個(gè)月內(nèi)被清除，只有大約20%的高危型HPV感染會(huì)長(zhǎng)期持續(xù)存在，導(dǎo)致浸潤(rùn)性宮頸癌的發(fā)生，HPV感染的持續(xù)化與宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)性增高有關(guān)［3］。因此，有效的免疫環(huán)境能夠監(jiān)視并清除HPV感染，減少宮頸癌的發(fā)生?；虿町惪捎绊憴C(jī)體免疫反應(yīng)，可能決定了宮頸癌變的危險(xiǎn)性大小。

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)是一種多效性的免疫因子，在病毒的免疫清除中具有重要作用［4］，TNF-α基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)具有生物學(xué)上的重要性，可以影響TNF-α的產(chǎn)量和活性，從而可能從基因水平影響疾病的易感性。本實(shí)驗(yàn)采用模板介導(dǎo)的染料終止物摻入－熒光偏振檢測(cè)(TDI－FP)的方法研究探討了TNF-α基因－238位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與宮頸癌以及HPV感染的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

宮頸癌患者58例，平均年齡(46.8±9.7)歲，主要來(lái)源于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一、二附屬醫(yī)院、陜西省腫瘤醫(yī)院婦科，其中原位癌8例、Ⅰ期14例、Ⅱ期27例、Ⅲ－Ⅳ期9例;對(duì)照組22例，平均年齡(42.7±7.2)歲，包括11例宮頸炎和11例正常宮頸者，其中1例宮頸炎標(biāo)本因取樣少無(wú)法檢測(cè)多態(tài)性予以剔除，宮頸炎標(biāo)本均經(jīng)過(guò)臨床確診且巴氏涂片檢查未見癌變跡象;正常宮頸組織來(lái)源于因非惡性腫瘤原因行子宮全切而且術(shù)后病理檢查確診無(wú)宮頸癌變的宮頸組織。

1.2 主要試劑、儀器

TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶(大連TaKaRa公司);Wizard? PCR Preps DNA Purification System、pGEM?－T Easy Vector SystemⅠ(美國(guó)Promega公司);GenEluteTMPlasmid Miniprep Kit(美國(guó)Sigma公司);DH5α菌株(第四軍醫(yī)大學(xué)全軍基因診斷研究所提供);96微孔板(美國(guó)MJ Research公司);PCR擴(kuò)增儀、熒光偏振檢測(cè)儀、熒光偏振檢測(cè)試劑盒(美國(guó)PerkinElmer公司)。根據(jù)GenBank收錄的TNF-α基因序列設(shè)計(jì)包含TNF-α－238位點(diǎn)的引物和 TDI探針，擴(kuò)增片段長(zhǎng)189bp，P1:5’－gttagaaggaaacagaccacagacc－3’，P2:5’－ggacacacaagcatcaaggataccc－3’，TDI探針:5’－aagacccccctcagaatc－3’，P2:5’－tccccatcctccctgctc－3’，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 陽(yáng)性對(duì)照的建立

用酚/氯仿法粗提 DNA，測(cè) OD 值，取 5.0μl DNA，加入上、下游引物各 1.0 μl，0.5 μl Taq 聚合酶，2.5 μl MgCl2，1.5 μl dNTPs，2.5 μl 10×Buffer，11.0μl雙蒸水，按照以下擴(kuò)增條件:95℃ 5 min;94℃ 30 s，54 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，總共 35 個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增，取10μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，參照 Wizard?PCR Preps DNA Purification System核酸純化試劑盒說(shuō)明書回收DNA片段。取3.0μl回收產(chǎn)物，1.0μl T4 DNA連接酶，1.0μl pGEM－T載體，2×T4連接酶緩沖液5.0μl，參照pGEM?－T Easy Vector SystemⅠ試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行連接反應(yīng)。5.0μl的連接產(chǎn)物與100μl的DH5α感受態(tài)細(xì)菌混合培養(yǎng)過(guò)夜，連續(xù)收集共10 ml菌液的菌體，參照 GenEluteTMPlasmid Miniprep Kit質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒DNA，由上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定。

1.4 TDI－FP法檢測(cè)－238位點(diǎn)的多態(tài)性

組織標(biāo)本初步處理后，PCR基因擴(kuò)增(反應(yīng)體系、條件同1.3 中的 PCR)，取 PCR 產(chǎn)物15.0 μl，加入以1∶9的比例預(yù)先混合的PCR Clean-up Reagent和 PCR Clean-up Dilution Buffer 6.0 μl，37 ℃水浴 2 h后95℃4 h，以消化PCR反應(yīng)中剩余的引物和dNTPs;消化后的產(chǎn)物7.0μl加入已配好的摻入反應(yīng)混合物(0.5 μl點(diǎn)突變檢測(cè)探針，1.5 μl Acyclopol Terminator MIX，0.05 μl Acyclopol聚合酶，2.0 μl 10×Buffer，8.95 μl去離子水)13.0 μl，95 ℃ 變性2 min，94 ℃ 15 s，49 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，總共30 個(gè)循環(huán)，15℃延伸10 min，以摻入檢測(cè)點(diǎn)突變的探針;將摻入產(chǎn)物10μl加入96孔微孔板，置于熒光偏振檢測(cè)儀Victor2 Multi Label Counter中進(jìn)行FP檢測(cè)。利用熒光偏振分析軟件“SNP Macro Victor 384 v 4.0”來(lái)分析檢測(cè)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以及遺傳平衡檢驗(yàn)

利用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)的方法檢驗(yàn)基因型頻率是否符合 Hardy Weinberg遺傳平衡定律。利用SPSS11.5進(jìn)行 χ2檢驗(yàn)，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增以及多態(tài)性檢測(cè)

以宮頸癌組織和宮頸炎分泌物中提取的DNA為模板，以預(yù)先設(shè)計(jì)的特異引物擴(kuò)增包含待測(cè)位點(diǎn)的目的片段，取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下觀察，與TNF-α基因－238位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物為一條位置大約在190 bp的清晰條帶，與預(yù)先設(shè)計(jì)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度接近(189 bp)(圖1)。提取的質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示:重組質(zhì)粒中含有包含待測(cè)位點(diǎn)的目的序列，序列長(zhǎng)度與預(yù)先設(shè)計(jì)的相同(189 bp)，與Genbank發(fā)表的已知序列同源。在后續(xù)的多態(tài)性檢測(cè)中采用與此序列對(duì)應(yīng)的模板DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)TNF-α基因－238位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，共檢測(cè)到兩個(gè)等位基因G、A，3個(gè)基因型:GG、GA、AA，其中G為優(yōu)勢(shì)等位基因，GG基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。各基因型的檢測(cè)結(jié)果示例見圖2(GG為高TAMRA、低R110;GA為高TAMRA、高R110;AA為低TAMRA、高R110;對(duì)照:低TAMRA低R110)。

圖1 包含－238位點(diǎn)的擴(kuò)增片段(189 bp)電泳結(jié)果Figure 1 The electropherotyping results of fragment including－238

圖2 TDI－FP法檢測(cè)TNF-α基因－238位點(diǎn)基因型Figure 2 Detection of all genotypes of－238 of TNF-α gene by TDI－FP

2.2 Hardy Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

TNF-α基因－238位點(diǎn)等位基因頻率已達(dá)遺傳平衡，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)研究資料具有較好的人群代表性。

2.3 宮頸癌與HPV感染的關(guān)系

所有宮頸癌標(biāo)本中共41例完成HPV檢測(cè)，HPV陽(yáng)性 36例(陽(yáng)性率為 87.8%)，陰性 5例。HPV16型感染陽(yáng)性率為68.3%(28例)，HPV18陽(yáng)性率為14.6%(6例)。

2.4 TNF-α基因－238位點(diǎn)多態(tài)性與宮頸癌的關(guān)系

TNF-α基因－238位點(diǎn)三種基因型的分布在宮頸癌和對(duì)照組之間沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，但是AA基因型在宮頸癌組為8.6%，對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)。兩個(gè)等位基因G和A在兩組之間也沒(méi)有顯著性差異(P＞ 0.05，OR=1.448，95%CI 0.685－3.064，見表1)。

2.5 TNF-α基因－238位點(diǎn)多態(tài)性與HPV感染的關(guān)系

同時(shí)檢測(cè)HPV感染和－238位點(diǎn)多態(tài)性的患者中，HPV陽(yáng)性者36例，HPV陰性者10例。TNF-α基因－238位點(diǎn)各等位基因的分布在HPV感染組與HPV感染陰性組之間非常相似，G等位基因在感染陽(yáng)性和陰性組中分別為83.3%和85.0%，A等位基因在感染陽(yáng)性組和感染陰性組分別為16.7%和15.0%，兩個(gè)等位基因的分布在兩組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05，OR=1.111，95%CI 0.347－3.559，見表2)。

表1 TNF-α基因－238位點(diǎn)多態(tài)性在宮頸癌和對(duì)照組中的分布Table 1 Frequency distribution of TNF-α－238 polymorphisms in cervical cancer group and control group

表2 TNF-α基因－238位點(diǎn)多態(tài)性在HPV感染陽(yáng)性組和陰性組中的分布 例(%)Table 2 Frequency distribution of TNF-α－238 polymorphisms in HPV positive group and nagative group cases(%)

3 討論

宮頸癌在中國(guó)每年有大約132 300例新發(fā)病例，位列女性惡性腫瘤的第二位［6］。高危型HPV已經(jīng)被確認(rèn)為宮頸癌的主要致癌原，尤其是HPV16型和18型。本研究中利用TDI－FP的方法檢測(cè)了41例宮頸癌組織的HPV感染情況，發(fā)現(xiàn)HPV感染陽(yáng)性率高達(dá)87.8%，其中，高危型16型感染陽(yáng)性率為68.3%，高于美國(guó)(59.5%)、非洲(42.5%)、歐洲(65.1%)［7］。由此可見，HPV 感染在不同國(guó)家和地區(qū)間存在一定的差異。

絕大多數(shù)疾病的發(fā)生發(fā)展都是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，人類基因組是一個(gè)高度變異的體系，多態(tài)性的存在導(dǎo)致了個(gè)體之間的表型不同，個(gè)體在基因構(gòu)成上的內(nèi)在差異可以從一定程度上闡明人體對(duì)疾病、毒物的易感性與耐受性、疾病臨床表現(xiàn)的多樣性以及治療效果的差異?；蚨鄳B(tài)性的研究不但可以揭示同一種疾病不同臨床表型的實(shí)質(zhì)，也可以為更具個(gè)體化的預(yù)防、診斷以及治療疾病打下基礎(chǔ)。有關(guān)基因多態(tài)性在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用已日益廣泛，包括臨床醫(yī)學(xué)的各個(gè)專業(yè)、各類疾病。一項(xiàng)meta分析表明:caspase－8的基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的易感性有關(guān)［8］。UGT2B17多態(tài)性與罹患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)［9］。TNF-α基因－238位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與疾病的相關(guān)性被廣泛研究［10－12］，其機(jī)制可能與堿基突變后影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，進(jìn)而影響了TNF-αmRNA的表達(dá)并最終導(dǎo)致TNF-α的產(chǎn)量改變有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)－238位點(diǎn)G置換為A與TNF-α 的產(chǎn)量下降相關(guān)［13］，攜帶－238A 的外周血細(xì)胞經(jīng)刺激后TNF-α的產(chǎn)量明顯下降［14］。

鑒于TNF-α在免疫清除方面的重要作用及宮頸癌與病毒感染持續(xù)化的密切關(guān)系，TNF-α基因的多態(tài)性與宮頸癌的關(guān)系近幾年受到關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α基因－238位點(diǎn) G→A多態(tài)性與宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)性降低有關(guān)［15－16］，本實(shí)驗(yàn)中此位點(diǎn)的各基因型、等位基因與宮頸癌的易感性未見明顯關(guān)聯(lián)，分析原因可能為:①基因的多態(tài)性在不同種族人群中的分布并不一致，導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他種族結(jié)果的不一致;②樣本量少，導(dǎo)致突變所致的A等位基因及AA基因型的數(shù)值太少，無(wú)法反映此位點(diǎn)多態(tài)性的真實(shí)情況，故后期研究宜盡量增大樣本量。

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