程紅兵，陳云霞，張雄鷹，趙良啟，曹艷芳

(1長治醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，長治 046000;2山西大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院;*通訊作者，E-mail:liangqi@sxu.edu.cn)

多糖是一類醛糖或酮糖組成的生物高分子，可以傳遞細(xì)胞之間大量的生物信息，在應(yīng)用研究上，對(duì)多糖分子進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆肿有揎椇徒Y(jié)構(gòu)改造，使其具有更多的生物活性或強(qiáng)化已有的生物活性，能更廣泛地應(yīng)用于臨床［1，2］。多糖的硫酸酯化是多糖結(jié)構(gòu)修飾的研究熱點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)表明硫酸酯化多糖具有抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力等作用。

本實(shí)驗(yàn)室獲得一株根瘤菌(Rhizobium sp.N613)，能產(chǎn)生豐富的胞外多糖(REPS)［3，4］。本研究采用氯磺酸－吡啶法對(duì)REPS進(jìn)行硫酸酯化修飾，得到硫酸酯化胞外多糖(sulfated rhizobium exopolysaccharide，SREPS)，觀察SREPS的抑瘤作用，以探討其抗腫瘤的作用機(jī)制，為臨床治療腫瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株

昆明種小鼠，體重(20±2)g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠肝癌細(xì)胞株(H22)，由山西省腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，本室以腹水型傳代保種。

1.2 藥物

Rhizobium sp.N613 胞外多糖(REPS)，由本實(shí)驗(yàn)室以Rhizobium sp.N613為生產(chǎn)菌株發(fā)酵純化制得，分子量為37.52 kD。利用氯磺酸－吡啶法對(duì)REPS進(jìn)行硫酸酯化修飾，獲得SREPS。環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。

1.3 試劑和儀器

生理鹽水(山東康寧藥業(yè)有限公司)。日立U－2010紫外分光光度計(jì)(日本日立公司)，恒溫振蕩器(太倉市科學(xué)儀器有限公司)，電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.4 急性毒性實(shí)驗(yàn)

選取健康昆明種小鼠，雌雄各半，每組10只，陰性對(duì)照組、4個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別采用蒸餾水、SREPS1.25 g/kg、2.50 g/kg、5.00 g/kg 和 10.00 g/kg 灌胃。灌胃前各組小鼠均禁食16 h，灌胃后12 h喂食，飼養(yǎng)觀察10 d。記錄動(dòng)物死亡數(shù)目、體重增長和進(jìn)食等情況，確定SREPS的半數(shù)致死量(LD50)。

1.5 SREPS對(duì)小鼠H22的抑制作用

抽取腹腔接種H22細(xì)胞8－10 d的小鼠腹水，用無菌生理鹽水稀釋成細(xì)胞數(shù)為1×106ml的瘤細(xì)胞懸液，選70只小鼠，每只小鼠于右前肢腋皮下接種0.2 ml。次日隨機(jī)分7組，每組10只，雌雄兼用且分養(yǎng)。SREPS 用無菌水配制為 0.5，1，2.5，5，10 mg/kg溶液，接種后24 h腹腔注射給藥，模型組腹腔注射生理鹽水，陽性對(duì)照組腹腔注射環(huán)磷酰胺(Cy)，每日一次，每次均 0.4 ml，連續(xù)給藥 10 d。于末次給藥后24 h，小鼠稱重，處死小鼠剝?nèi)×鰤K，摘取脾臟和胸腺，稱重，計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。腫瘤抑制率(%)=(荷瘤對(duì)照組平均瘤重－實(shí)驗(yàn)組平均瘤重)/荷瘤對(duì)照組平均瘤重×100%

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行組間方差檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

給藥后小鼠行為活動(dòng)、食欲、毛色等均正常，體重與陰性對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見表1)，未見有藥物引起的病變和中毒現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)過程小鼠無死亡，說明SREPS的LD50＞10 g/kg。按照我國五級(jí)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，SREPS屬于微毒物質(zhì)，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無急性毒性作用。

表1 急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of the acute toxicity test

2.2 對(duì)小鼠H22肉瘤的抑制作用

SREPS各劑量組對(duì)小鼠H22肉瘤均有一定抑制作用，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01，見表2)，其中 SREPS 以劑量為 2.5 mg/kg 的抑瘤率最高，達(dá)34.90%。雖然環(huán)磷酰胺組的抑瘤率最高，達(dá)到49.40%，但該組小鼠體重的增加值顯著小于其他各組，可能是由于其強(qiáng)烈的毒副作用所致。而SREPS各劑量組對(duì)小鼠的體重增加無明顯影響。該試驗(yàn)結(jié)果表明，各劑量組SREPS對(duì)小鼠肉瘤H22肉瘤均有良好的抑瘤作用，且具有良好的生物相容性。

表2 SREPS對(duì)H22荷瘤小鼠瘤體生長的影響Table 2 Effects of SREPS on tumor weight in H22 tumor-bearing mice

2.3 對(duì)荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響

從表3中可以看出，環(huán)磷酰胺組的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而SREPS各劑量組較模型組的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)升高，其中2.5 mg/kg劑量組對(duì)荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均有作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說明各劑量組SREPS對(duì)荷瘤小鼠胸腺和脾有保護(hù)作用。

表3 SREPS對(duì)荷瘤小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響Table 3 Effects of SREPS on thymus index and spleen index in H22 tumor－bearing mice

3 討論

硫酸酯化多糖是指含硫酸基團(tuán)的天然及半合成的多糖，為聚陰離子化合物。近年來發(fā)現(xiàn)硫酸酯化多糖具有抑制艾滋病病毒的活性［5］，使硫酸酯化多糖的研究成為熱點(diǎn)。繼而研究發(fā)現(xiàn)硫酸酯化多糖還具有抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等活性［6－8］。本實(shí)驗(yàn)室從一株根瘤菌(Rhizobium sp.N613)發(fā)酵液中提取分離胞外多糖(REPS)，采用氯磺酸－吡啶法對(duì)REPS進(jìn)行硫酸酯化修飾，得到硫酸酯化 REPS(SREPS)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠對(duì) SREPS的LD50＞10 g/kg，表明SREPS為低毒物質(zhì)。各劑量組SREPS對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤增長均具有一定的抑制作用，其中SREPS以劑量為2.5 mg/kg的抑瘤率最高，達(dá)34.90%。雖然環(huán)磷酰胺組的抑瘤率最高，但環(huán)磷酰胺在抑制腫瘤的同時(shí)對(duì)荷瘤小鼠的體重有一定的影響，對(duì)小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均有顯著的抑制，說明環(huán)磷酰胺可能導(dǎo)致脾和胸腺萎縮，進(jìn)而導(dǎo)致荷瘤小鼠免疫功能低下，長期使用該藥物對(duì)機(jī)體有較大的損害。而各劑量組SREPS對(duì)荷瘤小鼠的體重、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均無明顯影響，且2.5 mg/kg劑量組對(duì)荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)有顯著升高。表明各劑量組SREPS在抑制腫瘤的同時(shí)對(duì)荷瘤小鼠的免疫功能無影響，有些劑量還可促進(jìn)其免疫功能增強(qiáng)。從胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的變化情況來看，該硫酸酯化多糖制劑可能是通過增強(qiáng)機(jī)體自身的免疫力來達(dá)到抑瘤效果的。

SREPS作為一類天然半合成制劑，對(duì)肝癌H22小鼠有一定的抑瘤作用。其作用機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。

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