馬月霞 李 倩 王玉光

(1北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，100700;2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京，100050;3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京，100010)

2009年4月墨西哥首先爆發(fā)了一種人感染H1N1豬流感(the pandemic H1N1 2009 virus，pH1N1)疫情，人群普遍缺乏免疫力，全球總死亡病例18 449例，死因主要為重癥肺炎和呼吸衰竭。目前常用的抗流感病毒藥有神經(jīng)氨酸酶(NA)抑制劑，包括奧司他韋和扎那米韋等，和廣譜抗病毒藥利巴韋林。其中NA抑制劑療效可靠，耐藥性弱，早期(起病1～2 d)應(yīng)用具有較好的抗流感病毒作用。但通常，臨床實際應(yīng)用抗病毒藥物往往出現(xiàn)延遲用藥，對預(yù)后造成不利影響[1]。臨床上重癥流感的治療主要依靠對癥輔助治療和免疫抑制劑皮質(zhì)類固醇的使用，但是近期研究顯示[2]，皮質(zhì)類固醇藥物可能會導(dǎo)致病毒清除延遲、肺炎進行性加重而加劇流感患者的死亡。因此，目前流感重癥肺炎患者尚無特效療法。近年來，中醫(yī)藥在重大傳染病的救治上有了長足的發(fā)展，尤其是2009年新型H1N1流感廣泛應(yīng)用中醫(yī)藥治療，事實證明，如疏風(fēng)解毒顆粒、麻杏石甘湯等中藥抗流感有效[3]，但目前中藥注射液對流感重癥肺炎的療效并不確切，且無相關(guān)的實驗報道。

我們在本實驗應(yīng)用感染甲型H1N1流感病毒導(dǎo)致的重癥肺炎小鼠模型，觀察利巴韋林注射液、參麥注射液單用及聯(lián)合應(yīng)用對流感病毒感染所致的重癥肺炎小鼠的療效，為今后臨床中西藥靜脈注射液治療流感重癥肺炎提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 動物 雌性C57BL/6小鼠，體重14～16 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(軍)2012－003。

1.2 病毒 A/Beijing/501/2009(H1N1)流感病毒(簡稱BJ501)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物與流行病研究所免疫室提供。

1.3 藥品 利巴韋林注射液(貨號:1003167，0.1 g/2 mL)，山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。參麥注射液(貨號:20080521，10 mL/g)，河北省神威藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 動物模型的建立與分組 72只雌性C57BL/6小鼠，體重14～16 g，隨機分為模型組、參麥組、利巴韋林組、利巴韋林聯(lián)合參麥組，小鼠在乙醚輕度麻醉下，每只小鼠以20 μL 2×105TCID50病毒液滴鼻感染。模型組腹腔注射磷酸鹽緩沖液(PBS)66.6 mg/(kg·d);利巴韋林組于小鼠感染前12 h腹腔注射利巴韋林注射液66.6 mg/(kg·d);參麥組于小鼠感染后72 h腹腔注射參麥注射液20 mg/(kg·d);利巴韋林聯(lián)合參麥組分別于小鼠感染前12 h腹腔注射利巴韋林注射液66.6 mg/(kg·d)并于感染后72 h腹腔注射參麥注射液20 mg/(kg·d)。各藥均為1次/d，連續(xù)給藥5 d。

1.4.2 死亡保護率與體重的測定 每組小鼠10只。從感染日起開始每天準(zhǔn)確稱量小鼠體重，觀察一般狀態(tài)，如有無咳嗽、氣促、呼吸困難、煩躁、聳毛等，并記錄小鼠的存活情況，觀察期為14 d。

1.4.3 肺濕干比的測定 每組小鼠5只。感染后第4天，摘眼球放血處死小鼠后取出全肺，將其分別放在盛有生理鹽水的平皿中清洗2次，用吸水紙吸干表面水分，置于電子稱上稱出肺濕重。將稱量后的鼠肺放于60℃的烘箱中，24 h后取出稱肺干重。肺濕干比=(肺濕重－肺干重)/肺濕重×100%。肺濕干比是用以反映肺水腫嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。

1.4.4 肺病理檢測 每組小鼠3只。感染后第5天處死小鼠，取出全肺，盡量避免劃傷肺組織。將肺組織用10%甲醛固定，常規(guī)方法石蠟包埋切片，蘇木素伊紅(HE)染色，光鏡觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。請一位病理老師讀片，出示病理報告結(jié)果。

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 研究數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism5.0(GraphPad Software，SanDiego，CA，USA)軟件進行統(tǒng)計分析，采用t檢驗和方差分析等統(tǒng)計學(xué)方法，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 利巴韋林、參麥單用及聯(lián)合用藥對感染流感病毒的小鼠死亡保護作用 小鼠感染病毒后觀察其存活情況，觀察期至少14 d。由表1和圖1可見，模型組小鼠自感染6 d起開始死亡，感染第10天全部死亡。參麥組小鼠存活率為10%，利巴韋林組、利巴韋林聯(lián)合參麥組小鼠存活率均為100%。參麥組小鼠的存活率同模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，利巴韋林組、利巴韋林聯(lián)合參麥組與模型組小鼠的存活率相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)果見表1和圖1。

表1 小鼠感染BJ501病毒后的存活情況

2.2 利巴韋林、參麥注射液聯(lián)合用藥對感染流感病毒的小鼠體重變化影響 各組小鼠均于感染BJ501株流感病毒2 d后精神萎靡，體重開始大幅下降。參麥組小鼠體重于感染后第10天開始恢復(fù)，利巴韋林組和利巴韋林聯(lián)合參麥組小鼠體重在感染后第5天停止下降，感染后第8天開始恢復(fù)，感染后第10天起，利巴韋林聯(lián)合參麥組的小鼠體重增長趨勢高于利巴韋林組，統(tǒng)計有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果見表2和圖2。

圖1 小鼠感染BJ501病毒后的存活情況

表2 小鼠感染BJ501病毒后第10～14天各組小鼠體重變化

圖2 小鼠感染BJ501病毒后各組小鼠體重變化

2.3 利巴韋林、參麥注射液聯(lián)合用藥對流感病毒感染小鼠肺濕干比的影響 感染后第4天，處死、解剖小鼠。取肺組織，稱量肺濕重，干燥72 h后稱量其干重，計算濕干比。參麥組與模型組肺濕干比相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);利巴韋林組、利巴韋林聯(lián)合參麥組小鼠肺濕干與模型組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。

圖3 小鼠感染第4天的肺濕干比

2.4 利巴韋林、參麥注射液聯(lián)合用藥對流感病毒感染小鼠肺部病理變化的影響 感染后第5天，處死、解剖小鼠，取肺組織，肺組織經(jīng)4%甲醛固定后，石蠟包埋切片蘇木素伊紅(HE)染色，光鏡觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果見表4和圖4。

表3 小鼠感染第4天的肺濕干比

表4 各組小鼠肺部病理變化

圖4 各組小鼠第5天肺部病理變化

3 討論

甲型H1N1流感重癥[4]以急性起病，出現(xiàn)高熱，體溫多高于39℃，常伴隨劇烈咳嗽、胸痛，咳膿痰、血痰，并于48 h后迅速發(fā)展為呼吸衰竭、多臟器功能不全或衰竭，進行性血氧降低為主要特征。流感死亡病例尸檢發(fā)現(xiàn)[5]，其肺臟實變，重量增加，表面多灶、大片狀黃色或污穢滲出膜狀物，局部呈暗紅色。鏡下觀察顯示，肺泡內(nèi)水腫、出血和炎性滲出。急性肺損傷時可見肺泡上皮大量壞死、脫落，充滿肺泡腔，伴巨噬細(xì)胞增生，紅細(xì)胞等滲出，并且有肺透明膜形成，間質(zhì)水腫、出血，晚期氣管黏膜上皮彌漫性鱗狀上皮化生，肺組織幾乎完全實變，肺纖維化。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的流感與中醫(yī)的“時行感冒”類同，屬“溫病”范疇。甲型H1N1流感以發(fā)熱為主要特征，具有溫?zé)岵⌒再|(zhì)，在發(fā)病過程中有熱邪燔灼、耗氣傷津和熱迫血溢的病理表現(xiàn)。張偉[6]等病例觀察研究顯示，甲型H1N1感染病程第3～5天開始為本病的進展期，危重病例此期癥狀重，表現(xiàn)為發(fā)熱持續(xù)不退伴胸悶憋氣、倦怠乏力，第5～12天為極期，患者持續(xù)發(fā)熱、極度乏力，部分病例很快發(fā)生喘脫、厥脫。度過此期進入恢復(fù)期后重癥病例倦怠乏力、納差等持續(xù)時間相對較長。

利巴韋林作為一種核苷類似物，具有廣譜抗病毒的效果，是目前臨床上包括流感在內(nèi)的上呼吸道感染常用的抗病毒藥，但其不良反應(yīng)也相對較多[7－8]。參麥注射液，由《千金要方》的“生脈散”衍化而來，亦有源于《癥因脈治》中的“參冬飲”一說。臨床研究顯示，參麥注射液對阻斷炎性反應(yīng)及炎性反應(yīng)－免疫聯(lián)合反應(yīng)有重要作用，且能提高呼吸衰竭患者的細(xì)胞免疫[9－10]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6小鼠感染流感病毒BJ501株后，肺組織病理出現(xiàn)彌漫的炎性浸潤和病理損傷，說明小鼠重癥肺炎模型成功。模型組小鼠自感染第2天開始體重下降，精神不振，明顯發(fā)病;感染后第3～5天，小鼠一般狀況惡化，弓背蜷縮若惡寒顫栗狀，開始出現(xiàn)死亡;感染后第6～7天小鼠呼吸急促，并大量死亡;感染后第11天體重逐漸平穩(wěn)恢復(fù);感染第14天后停止死亡。

實驗研究顯示，利巴韋林注射液提早應(yīng)用對感染BJ501株流感病毒的小鼠具有明顯的保護作用，且肺水腫程度與模型組相比明顯減輕，但肺部病理結(jié)果顯示，利巴韋林并不能減輕肺組織炎性浸潤和病理損傷。這可能由于流感病毒感染后免疫應(yīng)答反應(yīng)即刻激活，而利巴韋林并不能逆轉(zhuǎn)免疫反應(yīng)所致的肺損傷。而參麥注射液，根據(jù)中醫(yī)辨證論治，流感重癥肺炎小鼠病程3～5 d為進展期，故于感染后72 h給予參麥注射液益氣扶正。結(jié)果顯示，參麥注射液單獨用藥雖對小鼠無明顯保護作用，肺部病理損傷亦無改善，但于感染后第10天開始對體重增長的變化趨勢優(yōu)于利巴韋林組，其表現(xiàn)符合臨床流感患者恢復(fù)期氣陰不足，需益氣養(yǎng)陰的治療特點。利巴韋林聯(lián)合參麥組，不僅對小鼠有明顯的保護作用，對小鼠的體重增長明顯優(yōu)于其他組。此外，利巴韋林聯(lián)合參麥組小鼠肺臟病理結(jié)果顯示，肺臟病變輕微，鏡下觀察支氣管、血管周圍炎性細(xì)胞浸潤較少，支氣管上皮細(xì)胞變性，肺組織實變范圍較小，僅有個別肺泡間隔增厚，對小鼠的肺部損傷有明顯的抑制作用，這可能與參麥注射液可以阻斷炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)機體的免疫功能的紊亂，減輕流感病毒感染啟動的免疫病理損傷有關(guān)，需進一步實驗證實。

綜上所述，本實驗根據(jù)甲型H1N1流感臨床中醫(yī)辨證理論指導(dǎo)，針對該病病程中熱毒和氣陰不足的關(guān)鍵病機，分別于感染前12 h、感染后72 h給予流感病毒重癥感染小鼠利巴韋林注射液和參麥注射液，結(jié)果顯示，二藥聯(lián)合應(yīng)用對重癥肺炎小鼠不僅促進恢復(fù)縮短病程，而且減輕了病理損傷，說明在流感進展期加入益氣養(yǎng)陰藥對疾病的預(yù)后及恢復(fù)具有重要作用[11]，中西藥聯(lián)合治療，標(biāo)本兼治，既顯示了中醫(yī)辨證治療的優(yōu)勢，又對臨床流感重癥病例的治療具有重要的指導(dǎo)意義。

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