西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心（西安710061）

張光偉△ 林 燕 朱寧紅 白艷萍 楊佩剛 劉恩岐＃

家兔屬于兔形目動物，和嚙齒類實驗動物相比，在系統(tǒng)發(fā)育上更接近人類，尤其是在代謝性疾病，如在糖尿病和動脈粥樣硬化方面的研究中備受青睞［1］。代謝綜合征包括中心性肥胖、糖耐量異常、脂代謝異常、胰島素抵抗和高血壓等病理狀態(tài)，這些病理變化都是心血管疾病的危險因素。糖代謝障礙和肥胖不僅是代謝綜合征的重要組成部分，也是糖尿病發(fā)病的危險因素。早期代謝綜合征的研究更多地重視胰島素抵抗和糖耐量異常在代謝綜合征中的作用，但目前的資料并不能證實其是引起該綜合癥所有成分的基本原因。隨著研究的深入，越來越多的研究者認識到肥胖和胰島素抵抗在引起代謝綜合征中的主要作用［2］。國際糖尿病組織在2005年制定的最新的代謝綜合征診斷標準更強調了中心性肥胖在代謝綜合征中的重要作用。我們嘗試利用高脂高糖飲食誘導日本大耳白家兔引起以糖代謝障礙和肥胖為主要表現(xiàn)的實驗模型，為代謝綜合征的發(fā)生和發(fā)病機理及糖尿病發(fā)生前期的研究提供研究工具。

材料和方法

1 實驗動物 日本大耳白兔由西安交通大學實驗動物中心提供。實驗開始前測定所有動物的體重、血糖和甘油三酯，進行隨即區(qū)組法分組。所有實驗用兔均在標準動物房飼養(yǎng)，溫度控制在（24±2）℃，濕度（55±15）%，光控（12h明／12h暗），自由采食和飲水。對照組動物給符合GB14924-2001標準的正常兔飼料，實驗組飼料配方為10%豬油、20%蔗糖和70%正常飼料的高脂高糖飼料（High Fat／Sucrose Diet，HFSD）。記錄所有動物體重變化，并計算其平均日進食量。

2 方 法

2.1 血指標測定：兩組動物每2周空腹抽血，EDTA-Na抗凝，3000轉／min 4℃離心20min，取上清，采用比色法測定試劑盒檢測空腹血糖和甘油三酯（中生北控生物科技股份有限公司，北京），放射免疫檢測試劑盒測定空腹胰島素（上海研晶生物科技有限公司）。

2.2 糖耐量試驗：第36周實驗結束后，進行靜脈內注射糖耐量試驗（Intravenous glucose tolerance test，IVGTT）。試驗前1d晚上8點禁食，次日早上8點進行IVGTT。兔子耳緣靜脈注射500g／L葡萄糖注射液（1.2ml／kg），每隔5、10、15、20、30、45、60、75、120min采血，測定血糖。計算糖耐量曲線下面積（Area under curve，AUC）［3］。

2.3 重要臟器和體內脂肪的分離：對動物進行安樂死，分離肝臟、心臟、腎臟、皮下脂肪（包括腋窩、腹股溝和肩胛區(qū)）及內臟脂肪（包括腸系膜、腹腔和腹膜后）并稱重。

圖1 體重（A）、血糖（B）和血甘油三酯（C）在實驗過程中的變化（與對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

2.4 統(tǒng)計學方法：數據采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析，采用t檢驗，以P﹤0.05為差別具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 高脂高糖飲食對日本大耳白兔體重的影響 實驗從12周開始直至實驗結束時，實驗組動物的體重顯著高于對照組（P﹤0.05）。實驗結束時實驗組動物平均體重達到（3.90±0.09）kg，顯著高于對照組的（3.18±0.27）kg，這說明實驗組家兔出現(xiàn)肥胖（圖1A）。

2 高脂高糖飲食對日本大耳白兔血糖和甘油三酯的影響 雖然在36周的實驗過程中也出現(xiàn)過實驗組動物的血糖和甘油三酯高于對照組的情況，但就整個實驗過程而言，兩組動物的血糖和甘油三酯未見明顯的升高或降低趨勢，兩組動物的血糖和甘油三酯無統(tǒng)計學差異。這表明，高脂高糖飲食對日本大耳白兔血糖和甘油三酯的影響并不明顯（圖1B和C）。

3 高脂高糖飲食對日本大耳白兔糖耐量的影響 第36周進行IVGTT，結果顯示，實驗組動物糖耐量AUC顯著高于對照組［（497.57±7.69）mg／（h·dl）vs（404.31±14.44）mg／（h·dl），（P ﹤0.01）］。在15～20min、20～30min、30～45min、45～60min和60～75min的AUC顯著高于對照組相應時間段的AUC（圖2A）。

4 高脂高糖飲食對日本大耳白兔尿糖的影響實驗第36周后，空腹抽血后，對動物實施安樂死，打開腹腔并暴露膀胱，穿刺抽取尿液，3000轉／min，離心20min，取上清檢測尿糖。實驗組和對照組之間尿糖水平無統(tǒng)計學差異（圖2B）。

5 高脂高糖飲食對日本大耳白兔胰島素水平的影響 采用放射免疫法測定第0周和實驗結束后第36周血胰島素，兩組對比沒有統(tǒng)計學差異（圖2C）。

6 高脂高糖飲食對日本大耳白兔脂肪含量及重要臟器重量的影響 第36周安樂死處死動物，分離脂肪。實驗組動物無論總脂肪和內臟脂肪重量均顯著高于對照組（圖2D）。同樣，內臟脂肪和體重之比也存在顯著差別［（0.09±0.01）g vs（0.06±0.01）g，（P＜0.05）（圖2E）］。分離兩組動物的重要臟器并稱重，實驗組動物臟器重量顯著高于對照組，見附表。

附表 兩組動物重要臟器重量比較

圖2 兩組家兔在靜脈注射葡萄糖耐量試驗

討 論

以內臟脂肪顯著增加為主要表現(xiàn)的中心性肥胖以及胰島素抵抗為主要表現(xiàn)的糖代謝紊亂是代謝綜合征重要的致病因素［2，4］。相關文獻和我們研究組都曾經用高脂飼料誘導家兔出現(xiàn)肥胖，家兔伴有血漿TG和TC升高［3，5］。綜合文獻報道，我們提出探索用含合適糖和脂肪的飼料誘導家兔出現(xiàn)肥胖、糖代謝紊亂等表現(xiàn)，為研究代謝綜合征和2型糖尿病的發(fā)病機理提供研究工具。

本實驗中，實驗組家兔從第8周開始體重增加明顯，到第12周實驗組家兔出現(xiàn)肥胖表現(xiàn)，體重明顯高于對照組，這種情況一直持續(xù)到第36周。實驗結束后分離動物皮下和內臟脂肪，實驗組家兔的總脂肪、內臟脂肪重量以及內臟脂肪和內臟脂肪和體重比明顯增高。這提示，內臟脂肪積聚對含高脂的飲食敏感。內臟脂肪的增加是評價中心性肥胖的重要指標之一。導致中心性肥胖的內臟脂肪所分泌的脂肪因子（如瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素以及糖皮質激素等）之間相互作用，最終導致代謝綜合征發(fā)生。另外，相對于外周脂肪來講，內臟脂肪具有明顯的胰島素抵抗作用。這可能與內臟脂肪的脂肪酸代謝異常有關。而胰島素抵抗也是代謝綜合征主要表現(xiàn)之一［6］。實驗組家兔血糖也沒有出現(xiàn)明顯的變化，但兩組動物靜脈注射糖耐量試驗出明顯差異，實驗組家兔糖耐量曲線下面積明顯高于對照組。兩組動物血漿胰島素和尿糖比較沒有統(tǒng)計學意義。實驗組家兔糖耐量異常，靜脈注射葡糖糖后，血漿葡萄糖清除效率降低，但兩組動物胰島素比較沒有顯著差異，這提示實驗組家兔可能出現(xiàn)胰島素抵抗，導致葡萄糖代謝障礙。這可能與游離脂肪酸濃度過高減弱了脂肪組織中的胰島素抗脂肪的分解作用減弱有關。而游離脂肪酸濃度的增高主要是由于內臟脂肪積聚造成的。已有的研究表明，肥胖家兔的脂肪細胞直徑較正常脂肪細胞明顯增大。肥胖脂肪細胞攝取和氧化葡萄糖的能力減弱，導致胰島素的利用率下降［7］。另外，由內臟脂肪分泌的內臟脂肪素也能夠影響胰島素信號通路［8］。需要指出的是，實驗組家兔在實驗進行過程中沒有出現(xiàn)明顯的高甘油三酯血癥，實驗結束時解剖家兔，也未見大動脈管壁出現(xiàn)明顯的動脈粥樣硬化病變。

實驗組家兔在實驗過程中出現(xiàn)了中心性肥胖和糖代謝紊亂的表現(xiàn)，這些都是代謝綜合征最主要的組成部分。但是代謝綜合征是十分復雜的一類疾病，本模型沒有誘導家兔出現(xiàn)高血壓和血漿甘油三酯升高。原因可能是因為代謝綜合征與年齡有很大的關系，年齡的增加是代謝綜合征的危險因素之一［6，7］。大周齡家兔給予高脂飲食后出現(xiàn)了高血壓和血漿甘油三酯升高［8］。因此考慮采用大周齡家兔，適當調整飼料中脂肪和糖的含量可能會誘導出更理想的代謝綜合征家兔模型。

［1］劉恩岐，范江霖.轉基因兔在動脈粥樣硬化研究中的應用及進展［J］.中國動脈硬化雜志，2003，11（4）：371-375.

［2］Carr DB，Utzschneider KM，Hull RL，et al.Intra-abdominal fat is a major determinant of the national cholesterol education program adult treatment panel III criteria for the metabolic syndrome［J］.Diabetes，2004，53（8）：2087-2094.

［3］Liu E，Kitajima S，Higaki Y，et al.High lipoprotein lipase activity increases insulin sensitivity in transgenic rabbits［J］.Metabolism，2005，54（1）：132-138.

［4］Alberti KG，Zimmet P，Shaw J，et al.IDF Epidemiology Task Force Consensus Group.The metabolic syndrome-a new worldwide definition［J］.Lancet，2005，366（9491）：1059-1062.

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［6］Bruce KD，Byrne CD.The metabolic syndrome：common origins of a multifactorial disorder［J］.Postgrad Med J，2009，85（1009）：614-621.

［7］Waqar AB，Koike T，Yu Y，et al.High-fat diet without excess calories induces metabolic disorders and enhances atherosclerosis in rabbits［J］.Atherosclerosis，2010，213（1）：148-155.

［8］Fukuhara A，Matsuda M，Nishizawa M，et al.Visfatin：aprotein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin［J］.Science，2005，307（5708）：426-430.