河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

杜春?！?戎瑞雪 王 夢(mèng)△△ 賈 薇△△△ 曹志然 (保定071000)

腫瘤是危害人類健康的惡性疾病之一，很多抗腫瘤藥物在殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常組織細(xì)胞，尤其是對(duì)骨髓和免疫細(xì)胞有一定的損害作用，從而降低肌體的抗腫瘤免疫功能，影響腫瘤的治療效果。許多研究表明，一些經(jīng)典的中藥方劑在腫瘤的放療和化療方面有一定減毒增效作用。十全大補(bǔ)湯(SQDBT)為氣血雙補(bǔ)的著名方劑，前期研究中發(fā)現(xiàn)十全大補(bǔ)湯及其多糖成分在體內(nèi)外均有明顯的抗腫瘤活性。［1-4］為了進(jìn)一步研究十全大補(bǔ)湯制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及抗腫瘤作用的機(jī)制，本文通過荷瘤小鼠結(jié)合體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，觀察了十全大補(bǔ)湯多糖成分的抗腫瘤作用及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8 周齡昆明種小鼠，雄性，40 只，體質(zhì)量(20±2.0)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)121027。

1.2 細(xì)胞株 H 22小鼠肝癌實(shí)體瘤株:由河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.3 主要藥品、儀器和試劑 十全大補(bǔ)湯組方中的生藥(人參、白術(shù)、茯苓、甘草、白芍、熟地黃、黃芪、當(dāng)歸、川芎、肉桂)均購(gòu)自保定市藥材公司，經(jīng)中醫(yī)學(xué)院馮天鑄教授鑒定均為真品。新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI-1640 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司;IL-2、TNF-α、IFN-γ ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳達(dá)科為生物技術(shù)公司，Annexin-Ⅴ-FITC/PI 雙染凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 公司，HF90 二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)。倒置顯微鏡(日本Olympus)，ELX－800 全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)寶特有限公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD 公司)。

1.4 十全大補(bǔ)湯總多糖的提取 人參、白術(shù)、茯苓各16 g，甘草8 g，當(dāng)歸24 g，川芎8 g，白芍16 g，熟地黃24 g，黃芪16 g，肉桂4 g，加20 倍體積水分別1、1、0.5 h 回流提取3 次，提取液合并冷卻后6 000 r/min，離心10 min;將上清液減壓回收至5 倍體積，加體積比為80%乙醇，靜置24 h，6 000 r/min 20 min;上述沉淀加5 倍體積蒸餾水溶解，加硫酸銨至沉淀完全溶解，用0.5%活性炭脫色后，抽濾后棄去沉淀;將濾液用少量80%乙醇洗滌多次去除多余硫酸銨，沉淀用少量水溶解，冷凍干燥后為總多糖成分，多糖獲得率為19.22%。

1.5 荷瘤小鼠模型的建立及分組處理 常規(guī)復(fù)蘇H22細(xì)胞，用含10%新生牛血清的培養(yǎng)基的RPMI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)在5%CO2培養(yǎng)箱中，傳代后，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞1×107接種于小鼠腹腔，10 d 后無菌條件下生長(zhǎng)良好的H22荷瘤小鼠腹水，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞活力＞95%，用無菌生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL，接種于小鼠右腋部皮下，每只注射0.2 mL (含1×105個(gè)細(xì)胞)。在接種腫瘤細(xì)胞后24 h 隨機(jī)分為5 組，每組8 只，稱重并用苦味酸標(biāo)記。1 組為陰性對(duì)照組:2 組為單純順鉑(DDP)組;3 組為順鉑聯(lián)合高劑量復(fù)合多糖組;4 組為順鉑聯(lián)合中劑量復(fù)合多糖組;5 組為順鉑聯(lián)合低劑量復(fù)合多糖組。3 組～5 組分別用168.4、84.2、42.1 mg/mL 總多糖灌胃，每天每只0.5 mL，連續(xù)10 d;2 組～5 組腹腔注射順鉑，1 mg/kg，1 次/d，連續(xù)10 d;陰性對(duì)照組用等量溫開水灌胃和腹腔注射等量生理鹽水。

1.6 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量及腫瘤生長(zhǎng)的影響 末次給藥后24 h 將小鼠稱重，小鼠眼球放血，分離血清備用。75%乙醇浸泡消毒，解剖摘取瘤塊、用濾紙吸干后稱重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(1－用藥組平均瘤質(zhì)量/模型對(duì)照組平均瘤質(zhì)量)×100%

1.7 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞凋亡的影響 無菌操作剝離腫瘤組織及脾臟，吸取表面的血液和組織液，稱重后立即置含有冰PBS 的培養(yǎng)皿中，分別制備脾細(xì)胞懸液和腫瘤細(xì)胞懸液，200 目篩網(wǎng)過濾后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL，AnnexinⅤ-PI 雙染后流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞的凋亡率。

1.8 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)TNF-α，IFN-γ 和IL-2 分泌水平的影響 采用ELISA 法，按試劑盒說明操作。

1.9 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS16.0 軟件處理，采用單因素方差分析和t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05 表示差異有顯著性。數(shù)據(jù)用±s 表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量及腫瘤增長(zhǎng)的抑制作用 結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)前各組小鼠體質(zhì)量差異無顯著，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)順鉑對(duì)照組小鼠體質(zhì)量明顯低于陰性對(duì)照組，順鉑聯(lián)合高、中劑量組小鼠體質(zhì)量較單純順鉑組有所增加，但仍低于陰性對(duì)照組。詳見表1。

表1 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量及瘤質(zhì)量的影響 (±s)

表1 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量及瘤質(zhì)量的影響 (±s)

注:與陰性對(duì)照組比較，* P＜0.05;與單純順鉑組比較，▲P＜0.05

組別 例數(shù) 體質(zhì)量(g)實(shí)驗(yàn)第1天實(shí)驗(yàn)結(jié)束 瘤質(zhì)量(g)抑瘤率陰性對(duì)照組8 22.21±1.89 33.23±2.24 1.35±0.33順鉑對(duì)照組 8 23.02±1.94 25.67±3.43* 1.05±0.21* 22%順鉑+高劑量多糖組 8 22.53±1.78 28.02±2.12＊▲ 0.87±0.28＊▲ 36%順鉑+中劑量多糖組 8 21.98±1.49 27.18±199.00＊▲ 0.85±0.25＊▲ 37%順鉑+低劑量多糖組 8 23.12±1.98 26.89±2.21*1.05±0.27 22%

2.2 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果顯示:順鉑可明顯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，但主要以晚期凋亡(壞死)為主，與陰性對(duì)照組比差異有顯著性(P＜0.05);而順鉑聯(lián)合各劑量多糖組腫瘤細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯高于順鉑對(duì)照組，且主要以早期凋亡為主，其中以順鉑聯(lián)合高劑量多糖組作用最強(qiáng)。詳見表2、圖1。

表2 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響 (±s)，%

表2 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響 (±s)，%

注:與陰性對(duì)照組比較，* P＜0.05;與單純順鉑組比較，▲P＜0.05

分組 例數(shù) 早期凋亡率(%) 晚期凋亡率(%)8 2.45±0.24 4.23±1.21順鉑對(duì)照組 8 3.65±1.63 23.87±2.23*順鉑+高劑量多糖組 8 16.33±2.45＊▲ 28.56±3.67＊▲順鉑+中劑量多糖組 8 14.89±3.34＊▲ 26.78±2.23＊▲順鉑+低劑量多糖組 8 13.76±2.87＊▲ 23.24±1.98陰性對(duì)照組＊▲

圖1 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

2.3 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠脾細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果顯示順鉑可明顯誘導(dǎo)荷瘤小鼠脾細(xì)胞的凋亡，其早期凋亡率和晚期凋亡率均高于陰性對(duì)照組，順鉑聯(lián)合各劑量十全大補(bǔ)湯總多糖組脾細(xì)胞的凋亡率均明顯低于單純順鉑組(P＜0.05)，但仍高于單純陰性對(duì)照組(P＜0.05)，表明十全大補(bǔ)湯總多糖可拮抗順鉑誘導(dǎo)的脾細(xì)胞的凋亡，對(duì)脾細(xì)胞有一定保護(hù)作用。詳見表3、圖2。

表3 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠脾細(xì)胞凋亡的影響 (±s)，%

表3 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠脾細(xì)胞凋亡的影響 (±s)，%

注:與陰性對(duì)照組比較，* P＜0.05;與單純順鉑組比較，▲P＜0.05

分組 例數(shù) 早期凋亡率(%) 晚期凋亡率(%)8 1.34±0.43 2.23±1.32順鉑對(duì)照組 8 12.87±2.76* 25.66±3.43*順鉑+高劑量多糖組 8 5.33±1.47＊▲ 13.43±2.09＊▲順鉑+中劑量多糖組 8 6.54±0.87＊▲ 15.78±3.56＊▲順鉑+低劑量多糖組 8 8.90±2.03＊▲ 16.24±3.12陰性對(duì)照組＊▲

圖2 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠脾細(xì)胞凋亡的影響

2.4 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠脾臟TNF-α、IFN-γ、IL-2 的影響 結(jié)果顯示順鉑組小鼠脾細(xì)胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2 的量明顯低于陰性對(duì)照組(P＜0.05)，順鉑聯(lián)合各劑量多糖組小鼠脾細(xì)胞TNF-α、IFN-γ、IL-2 的分泌水平明顯高于單純順鉑組(P＜0.05)，順鉑聯(lián)合各劑量多糖組小鼠脾細(xì)胞IL-2 的分泌水平高于陰性對(duì)照組，但順鉑聯(lián)合各劑量多糖組TNF-α 的分泌水平仍低于陰性對(duì)照組;順鉑+低劑量多糖組IFN-γ 的分泌與陰性對(duì)照組差異無顯著(P＞0.05)。提示十全大補(bǔ)湯總多糖可刺激荷瘤小鼠的脾細(xì)胞合成和分泌TNFα、IFN-γ 和IL-2，但對(duì)各種細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)程度不同。詳見表4。

表4 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠脾臟TNF-α、IFN-γ、IL-2 的影響 (±s)，pg/mL

表4 十全大補(bǔ)湯總多糖對(duì)荷瘤小鼠脾臟TNF-α、IFN-γ、IL-2 的影響 (±s)，pg/mL

注:與陰性對(duì)照組比較，* P＜0.05;與單純順鉑組比較，▲P＜0.05

分組 例數(shù) TNF-α IFN-γ IL-2陰性對(duì)照組569.22±4.43 74.09±2.12 80.55±5.65順鉑對(duì)照組 8 298.87±4.87* 47.32±2.30* 45.87±5.45*順鉑+高劑量多糖組 8 479.43±5.44＊▲ 108.31±3.01＊▲ 139.08±4.79＊▲順鉑+中劑量多糖組 8 432.86±4.87＊▲ 96.12±3.31＊▲ 132.86±4.87＊▲順鉑+低劑量多糖組 8 320.76±4.32＊▲ 72.04±2.34▲ 120.76±4.32 8＊▲

3 討論

惡性腫瘤作為威脅人類健康的主要?dú)⑹种?，目前常用的化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)肌體的正常組織尤其是免疫系統(tǒng)帶來嚴(yán)重?fù)p傷，從而影響腫瘤的治療效果。尋找無毒害作用的抗癌藥物成為廣大研究人員追求的共同目標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)來源于中藥的多糖不僅能對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，而且還能提高人體免疫力，其獨(dú)特的藥理作用已引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。大量研究證實(shí)多糖抗腫瘤作用的機(jī)制主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面:①直接作用于腫瘤細(xì)胞，可通過影響腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜、干擾細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用;②通過激活淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，活化補(bǔ)體系統(tǒng)，有效促進(jìn)多種細(xì)胞因子的分泌和表達(dá)，增強(qiáng)肌體免疫功能，發(fā)揮抗腫瘤作用。［5］因此，中藥多糖作為一種免疫增強(qiáng)劑輔助化療、放療已成為腫瘤治療的重要組成部分。但目前對(duì)多糖的研究大多是針對(duì)單味中藥多糖，有關(guān)中藥方劑中復(fù)合多糖的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用的研究少有報(bào)道。

中藥方劑是由不同藥物根據(jù)中藥配伍原則組成，各藥之間相輔相成，具有比單味藥更強(qiáng)的作用。十全大補(bǔ)湯是補(bǔ)血益氣的代表方劑，臨床主要用于貧血、產(chǎn)后虛弱、術(shù)后恢復(fù)等。有研究表明十全大補(bǔ)湯可抑制腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移、提高荷瘤肌體的免疫功能。［6-7］我們前期研究發(fā)現(xiàn)十全大補(bǔ)湯總多糖在體內(nèi)外明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并能改善化療所致的惡液質(zhì)、貧血和白細(xì)胞下降等毒副作用。［2］本文通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)合體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法進(jìn)一步研究了十全大補(bǔ)湯總多糖在腫瘤化療中減毒增效的作用機(jī)制。結(jié)果顯示十全大補(bǔ)湯總多糖可明顯促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且以早期凋亡為主?；熕幬镒畲蟮亩靖弊饔檬窃跉[瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)免疫細(xì)胞也有殺傷活性，從而降低了肌體抗腫瘤免疫力，本文結(jié)果表明十全大補(bǔ)湯總多糖可明顯拮抗順鉑所致的脾細(xì)胞的凋亡，對(duì)脾細(xì)胞具有保護(hù)作用。研究表明荷瘤肌體的抗腫瘤免疫以細(xì)胞免疫為主，在腫瘤細(xì)胞抗原的刺激下CD4+T 細(xì)胞活化、分化為Th1 細(xì)胞，通過分泌IL-2，IFN-γ，TNF-α 等細(xì)胞因子作用于其他免疫細(xì)胞從而發(fā)揮抗腫瘤免疫。［8－9］本研究結(jié)果顯示接種腫瘤細(xì)胞后荷瘤小鼠血清中均可監(jiān)測(cè)到IL-2，IFN-γ，TNF-α 的分泌，其中以TNF-α 分泌水平最高。順鉑可降低荷瘤小鼠上述3 種細(xì)胞因子的分泌，而順鉑聯(lián)合應(yīng)用十全大補(bǔ)湯總多糖組各種細(xì)胞因子的分泌水平均顯著高于單純順鉑化療組，尤其是IL-2 和IFN-γ 的分泌水平均高于陰性對(duì)照組，且有劑量依賴性，表明十全大補(bǔ)湯總多糖可拮抗順鉑導(dǎo)致的細(xì)胞免疫功能受損狀態(tài)，提高荷瘤小鼠的抗腫瘤細(xì)胞免疫功能。

綜上所述，十全大補(bǔ)湯總多糖可明顯協(xié)同順鉑導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制一方面可能與該復(fù)方多糖直接作用于腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡;其次也可能是通過激活NK 細(xì)胞，單核吞噬細(xì)胞，CTL等免疫細(xì)胞，促進(jìn)其合成分泌細(xì)胞因子，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，即十全大補(bǔ)湯總多糖抗腫瘤作用機(jī)制是多方位、多環(huán)節(jié)，不僅可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，而且還從細(xì)胞水平，分子水平調(diào)節(jié)荷瘤肌體的免疫功能。今后若能借助于先進(jìn)的分離和分析技術(shù)，結(jié)合臨床實(shí)踐進(jìn)行更加深入的研究，進(jìn)一步發(fā)揮其抗腫瘤的增效低毒的優(yōu)勢(shì)。

［1］戎瑞雪，王蓓，曹志然.十全大補(bǔ)湯總多糖的體外抗腫瘤作用［J］.山東醫(yī)藥，2011，51 (7):15－16

［2］曹志然，王潔，王蓓，等.中藥復(fù)方多糖體內(nèi)外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2010，16 (6):480－483

［3］韓艷梅，曹志然，王曉輝，等.十全大補(bǔ)湯對(duì)移植乳腺癌小鼠化療的減毒增效作用［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，28(5):358－359

［4］曹志然.十全大補(bǔ)湯對(duì)荷瘤鼠脾細(xì)胞增殖、IL-6、TNF 分泌的影響［J］.上海免疫學(xué)雜志，2002，22 (6):370

［5］陳艷.中藥多糖抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)與臨床研究，2010，18 (2):123－126

［6］劉華巖，王軍.十全大補(bǔ)湯對(duì)小鼠骨髓源性細(xì)胞向腦內(nèi)遷移的影響［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，40 (12 ):1 075－1 078

［7］李松，吳青華，陳暢，等.多糖抗腫瘤活性的最新研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2007，28 (3):213－216

［8］Gajewski TF，Schreiber H，F(xiàn)u YX.Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment ［J］.Nat Immunol，2013，14 (10):1 014－1 022

［9］Lakshmi Narendra B，Eshvendar Reddy K，Shantikumar S，et al.Immune system:a double-edged sword in cancer ［J］.Inflamm Res，2013，62 (9):823－834