陳藝升， 應春妹， 李永麗

(上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院檢驗科，上海200127)

鮑曼不動桿菌是一種臨床常見的革蘭陰性非發(fā)酵菌，是引起院內(nèi)感染的主要條件致病菌之一。近年來，鮑曼不動桿菌分離率不斷增加，尤其是耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(carbapenems resistant Acinetobacter baumannii)，且此類菌株往往同時對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類等抗菌藥物耐藥，給臨床治療帶來極大困難。此外，耐藥株極易爆發(fā)流行，尤其是在神經(jīng)外科和重癥監(jiān)護病房［1］。為了解仁濟醫(yī)院神經(jīng)外科病房鮑曼不動桿菌耐藥性變遷和分子流行特征，本研究收集2011年7月至2013年6月神經(jīng)外科病房臨床分離的鮑曼不動桿菌共87株，采用瓊脂稀釋法檢測其對臨床常用抗菌藥物的敏感性，多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)技術(shù)對其進行基因型別分析，了解神經(jīng)外科近年來分離的鮑曼不動桿菌耐藥性變遷和主要基因型別，為指導臨床用藥和控制醫(yī)院感染提供依據(jù)。

材料和方法

一、材料

1.菌株 收集仁濟醫(yī)院2011年7月至2013年6月神經(jīng)外科分離的鮑曼不動桿菌共87株，剔除同一患者重復標本。所有菌株均采用西門子Micro Scan WalkAway 96 plus細菌鑒定儀鑒定。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌(ATCC 25922)和銅綠假單胞菌(ATCC 27853)。

2.儀器與試劑 Micro Scan WalkAway 96 plus細菌鑒定儀(西門子公司，德國);veriti 96孔梯度聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀(ABI，美國);瓊脂糖凝膠電泳儀(Biorad);凝膠成像系統(tǒng)(上海天能技術(shù)有限公司);哌拉西林、他唑巴坦、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢噻肟、美羅培南、慶大霉素、阿米卡星、米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星、磺胺甲口惡唑、甲氧芐啶等抗菌藥物購自上?？萍阉帣z器材公司;頭孢肶肟由上海施貴寶制藥有限公司惠贈;亞胺培南由杭州默沙東制藥有限公司惠贈。

二、方法

1.體外藥物敏感性試驗 采用瓊脂稀釋法檢測87株鮑曼不動桿菌對12種抗菌藥物的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，結(jié)果判讀參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2012年標準［2］。

2.MLST 從血平板上挑取單個菌落于300μL 0.85%的生理鹽水中，制成細菌懸液，以8 600×g離心5 min，棄上清液，加入300μL無菌雙蒸水重懸細菌，100℃水浴15 min，12 000×g離心5 min，取上清液即為DNA模板。參照鮑曼不動桿菌 MLST數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/abaumannii/)設計 gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和 rpoD 7個管家基因［3］引物序列，見表1，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。PCR總反應體系為25μL，其中 10×PCR緩沖液(含MgCl2)2.5 μL，dNTP(各 2.5 mmol/L)2 μL，上、下游引物 (10 μmol/L)各 0.5 μL，Taq 酶0.25 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 18.25 μL。反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性30 s、52～56℃退火45 s、72℃延伸1 min，共30個循環(huán);最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定單一條帶后，送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行雙向測序。

表1 PCR引物序列和產(chǎn)物長度

結(jié) 果

一、藥物敏感性試驗

87株鮑曼不動桿菌對12種抗菌藥物普遍耐藥，對米諾環(huán)素的耐藥率最低，為32.2%，對其它抗菌藥物的耐藥率均在70%以上;對磺胺甲口惡唑-甲氧芐啶耐藥，見表2。耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌67株，占77.0%。比較連續(xù)3年神經(jīng)外科鮑曼不動桿菌耐藥率變遷發(fā)現(xiàn)，除米諾環(huán)素耐藥率略有降低外，對其余抗菌藥物的耐藥率均有上升趨勢。

二、MLST

87株鮑曼不動桿菌可分為6個ST型，其中ST-208型 45株，占 51.7%;ST-191型 15株，占17.2%;ST-540型8株;ST-195型和ST-381型各2株;ST-368型1株;余下14株都至少有一個新的等位基因，無法鑒定ST型。除ST-381外，其余5種型別均屬于CC92克隆群，具有基因同源性。ST-208型是仁濟醫(yī)院神經(jīng)外科鮑曼不動桿菌的主要克隆流行株。綜合87株鮑曼不動桿菌的MIC結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ST-208型和ST-191型是耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的主要流行型別，是造成神經(jīng)外科耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌分離率高的重要原因。見表3。

表2 87株鮑曼不動桿菌對12種抗菌藥物的耐藥率

表3 ST基因型數(shù)量及構(gòu)成比 ［株(%)］

討 論

鮑曼不動桿菌是一種重要的醫(yī)院感染條件致病菌，常引起肺炎、菌血癥、尿路感染、繼發(fā)性腦膜炎、手術(shù)部位感染等［4］。碳青霉烯類藥物(如亞胺培南和美羅培南)是治療鮑曼不動桿菌感染的首選藥物，但是隨著抗菌藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的分離率和耐藥率均呈現(xiàn)上升趨勢，使臨床治療和醫(yī)院感染控制面臨嚴峻挑戰(zhàn)。2011年上海地區(qū)細菌耐藥性監(jiān)測結(jié)果顯示鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為53%和55%［5］，同年中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測結(jié)果顯示對兩者的耐藥率為60.4%和61.4%［6］。

神經(jīng)外科患者多存在較嚴重的基礎(chǔ)疾病，感染鮑曼不動桿菌的耐藥性也相對較高。本研究中分離的87株鮑曼不動桿菌對12種抗菌藥物普遍耐藥，對米諾環(huán)素的耐藥率稍低，為32.2%，對其他抗菌藥物的耐藥率均在70.0%以上。87株鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率高達74.7%和80.5%，其中耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌67株，占77.0%。進一步分析發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌往往同時對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類等藥物高度耐藥。連續(xù)3年鮑曼不動桿菌耐藥性變遷顯示，除米諾環(huán)素外，對其它抗菌藥物的耐藥率均有逐年增加趨勢。以亞胺培南為例，2011年的耐藥率僅為59.3%，2012年上升至78.0%，而2013上半年的耐藥率已高達89.5%。

耐藥鮑曼不動桿菌極易造成醫(yī)院感染流行，Bernards、Clímaco 等［7-8］均報道有鮑曼不動桿菌的院內(nèi)流行，對菌株進行基因分型，分析不同型別之間的同源關(guān)系，有利于了解菌株流行特征，能夠及時發(fā)現(xiàn)菌株爆發(fā)流行并采取控制措施。MLST技術(shù)是國際公認的型別鑒定方法，該法操作簡便，可追溯菌株的同源性和傳播性，且鑒定結(jié)果可用于不同實驗室之間的比較。Huang等［9］對國內(nèi)某家醫(yī)院連續(xù)6年分離的耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌進行MLST分型，發(fā)現(xiàn)存在CC92克隆株流行傳播。Gurung等［10］近期的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)院內(nèi)ST-191型碳青霉烯類耐藥株的播散。He等［11］的研究證實鮑曼不動桿菌CC92克隆群已在全國范圍內(nèi)流行。本研究中的87株鮑曼不動桿菌可分為6個 ST基因型，其中 ST-208型 45株(51.7%)，是神經(jīng)外科的主要流行型別，其次是ST-191型(17.2%)。除 ST-381以外，其余5種型別均屬于CC92克隆群，具有基因同源性。比較3年內(nèi)神經(jīng)外科鮑曼不動桿菌流行型別可知，ST-208一直是仁濟醫(yī)院神經(jīng)外科最主要的流行型別，而ST-191型從2011年的3.7%上升到2012年的29.3%(12/41)，且在2013年也占有一定的比例，是一種新的流行株。結(jié)合MIC結(jié)果，67株碳青霉烯類耐藥株中ST-208型(37株)和ST-191型(13株)占了64.1%，所以ST-208型和ST-191型的流行傳播是導致仁濟醫(yī)院神經(jīng)外科耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌分離率高的重要原因。

本研究結(jié)果表明，仁濟醫(yī)院神經(jīng)外科鮑曼不動桿菌耐藥性嚴峻，耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌分離率高，且存在耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌克隆株傳播。鑒于臨床對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌尚缺乏良好的治療方案，需加強耐藥性監(jiān)測及合理使用抗菌藥物，提高醫(yī)護人員消毒意識，避免此類菌株爆發(fā)流行。

［1］Fu Y，Zhou J，Zhou H，etal.Wide dissemination of OXA-23-producing carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clonal complex 22 in multiple cities of China［J］.J Antimicrob Chemother，2010，65(4):644-650.

［2］Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:twenty-first informational supplement［S］.M100-S22，CLSI，2012.

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