張國良， 劉鹥雯， 何怡青， 楊翠霞， 王文涓， 杜 艷， 高 鋒

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院中心實驗室，上海200233)

惡性腫瘤發(fā)生時，外周血單核細(xì)胞浸潤至腫瘤間質(zhì)，逐步被誘導(dǎo)分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage，TAM)。近年研究發(fā)現(xiàn)TAM不具有殺傷腫瘤細(xì)胞的功能，反而能促進(jìn)腫瘤生長和發(fā)展，其表型特征和功能與M2型巨噬細(xì)胞極為相似，是一種“促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的 M2型巨噬細(xì)胞”［1］。TAM是腫瘤間質(zhì)中的主要免疫細(xì)胞，臨床研究表明TAM數(shù)量與腫瘤患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［2］，利用基因或治療性方法清除腫瘤局部的TAM將會抑制腫瘤進(jìn)展［3-4］。然而，目前缺少一種理想的TAM細(xì)胞模型來進(jìn)行相關(guān)機(jī)制的研究。

在研究TAM與腫瘤細(xì)胞相互作用機(jī)制的體外試驗中，目前應(yīng)用最多的是利用佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)、白細(xì)胞介素4(interleukin 4，IL-4)和白細(xì)胞介素13(interleukin 13，IL-13)誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞作為TAM模型。在本研究中，我們利用IL-4和IL-13刺激新鮮分離的人外周血單核細(xì)胞，通過檢測單核細(xì)胞表面的分子標(biāo)志(CD14、CD204和CD206)、分泌的細(xì)胞因子及其殺傷功能的變化來確定其是否分化為TAM，以探索能模擬腫瘤微環(huán)境中TAM的細(xì)胞模型，便于展開相關(guān)研究。

材料和方法

一、試劑和儀器

人乳腺癌細(xì)胞株BT-549(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心);RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清(Gibco，美國);別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)-抗CD14抗體及同型對照抗體、白細(xì)胞介素10(interleukin 10，IL-10)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒 (eBioscience，美國)，藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)-抗CD204抗體及同型對照抗體(R＆D，美國)，PE-抗 CD206抗體及同型對照抗體(Biolegend，美國);Hoechst 33342(碧云天，中國);流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，CA，美國);倒置熒光顯微鏡(Olympus IX70，日本)。

二、方法

1.分離人外周血單核細(xì)胞 取正常人體檢抗凝血，加入等體積磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)充分混勻，將稀釋的全血按2∶1比例緩慢沿試管壁鋪在淋巴細(xì)胞分離液上，室溫下1 500×g離心20 min，小心吸出中間的云霧層細(xì)胞至另一離心管中，用RPMI1640培養(yǎng)液500×g離心10 min洗滌2次。將洗滌后的細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清以及100 U/mL青、鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL，臺盼蘭拒染試驗示活細(xì)胞＞95%。將細(xì)胞按以上濃度接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～4 h后吸出培養(yǎng)基，用37℃預(yù)熱的培養(yǎng)液清洗3次，將未貼壁細(xì)胞洗脫。

2.單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化 上述貼壁細(xì)胞經(jīng)乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)消化后離心，棄上清后重懸，接種5×105個單核細(xì)胞于T25培養(yǎng)瓶中，對照組為正常培養(yǎng)，實驗組加入IL-4和IL-13刺激。IL-4和IL-13濃度均為20μg/mL［5］。確定 IL-4和 IL-13刺激時間的預(yù)實驗如下:用上述濃度的IL-4和IL-13分別刺激單核細(xì)胞，分別在3、4、5和6 d時用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測其表面分子標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果顯示，單核細(xì)胞表面CD204和CD206的表達(dá)在IL-4和IL-13刺激5 d后明顯增加。因此，在正式實驗中我們用20 ng/mL的IL-4和IL-13刺激單核細(xì)胞5 d，誘導(dǎo)其分化。

3.FCM檢測單核細(xì)胞表面特異性抗原 實驗分為常規(guī)培養(yǎng)組和IL-4/IL-13誘導(dǎo)組。單核細(xì)胞經(jīng)EDTA消化后離心，棄上清后用PBS洗滌2次，計數(shù)，2組細(xì)胞均按每管約106個細(xì)胞的數(shù)量，分別收集至2個EP管中，其中實驗管加入適量鼠抗人CD14單克隆抗體，對照管加入等體積CD14同型對照抗體，室溫避光溫育30 min，PBS洗滌2次，500μL PBS重懸，移至流式測試管中，上機(jī)檢測。應(yīng)用同樣方法檢測單核細(xì)胞表面CD204和CD206的表達(dá)。

4.ELISA檢測單核細(xì)胞分泌的IL-10 將分離的單核細(xì)胞接種于24孔板(2×105/孔)，對照孔為正常培養(yǎng)孔，實驗孔加入IL-4和IL-13(均為20 ng/mL)，培養(yǎng)5 d后收集上清，離心去沉渣后凍存于－20℃冰箱。按上述方法收集3次單核細(xì)胞上清，每次均為3復(fù)孔，然后按照ELISA試劑盒說明書提供的步驟檢測上清中的IL-10含量。

5.BT-549細(xì)胞轉(zhuǎn)染紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP) 將處于對數(shù)生長期的BT-549細(xì)胞接種于6孔板(2×105/孔)，待24h細(xì)胞生長至40%～50%融合時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染，棄去上清，于6孔板的每孔中加入含低濃度胎牛血清(＜10%)的RPMI1640培養(yǎng)基1mL，按感染復(fù)數(shù)(multiplicity，MOI)5、10、15、20 加入不同滴度的慢病毒顆粒(Lentivirus-RFP)，同時加入聚凝胺(終濃度5μg/mL)，充分搖勻后置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。作用8～12 h后用PBS洗滌細(xì)胞，加入10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24、48和72h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的紅色熒光和細(xì)胞毒性反應(yīng)，以此確定大致轉(zhuǎn)染效率(最佳點時拍照)。利用嘌呤霉素篩選陽性細(xì)胞，每隔2～3天加1次抗菌藥物，連續(xù)篩選2～3次，之后繼續(xù)培養(yǎng)、傳代擴(kuò)增，建立穩(wěn)定的細(xì)胞株。

6.Hoechst染色檢測腫瘤細(xì)胞凋亡 將分離的單核細(xì)胞接種于24孔板(5×104/孔)，對照孔為正常培養(yǎng)孔，實驗孔加入IL-4和IL-13(均為20 ng/mL)，培養(yǎng)5 d后棄上清，EDTA消化后離心，棄上清后用RPMI1640培養(yǎng)液重懸，將其分別加入事先接種RFP-BT-549細(xì)胞的(2×104/孔，培養(yǎng)24h)24孔板中。2種細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗滌后加入適量Hoechst 33342染液，4℃避光溫育過夜。觀察之前PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下細(xì)胞核濃縮、染色致密者即為處于凋亡狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞，計數(shù)。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、外周血單核細(xì)胞鑒定

分離人外周血單核細(xì)胞后，利用FCM檢測單核細(xì)胞表面特異標(biāo)志物CD14的表達(dá)率，以確定其純度。結(jié)果顯示所分離單核細(xì)胞的CD14表達(dá)率為97.56%±1.85%。見圖1。

二、IL-4/IL-13誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)TAM標(biāo)志分子

正常培養(yǎng)組單核細(xì)胞表面CD204和CD206的表達(dá)率均較低，IL-4/IL-13(20 ng/mL)誘導(dǎo)組單核細(xì)胞表面CD204和CD206的表達(dá)率均顯著增高(P＜0.001)，CD14的表達(dá)率無明顯差異。見圖2。

圖1 人外周血單核細(xì)胞表面CD14表達(dá)

圖2 單核細(xì)胞表面CD14、CD204和CD206的表達(dá)

三、IL-4/IL-13促進(jìn)單核細(xì)胞分泌IL-10

常規(guī)培養(yǎng)組單核細(xì)胞的IL-10分泌量較低［(6.19±3.12)ng/mL］，IL-4/IL-13(20 ng/mL)刺激組單核細(xì)胞的IL-10分泌量顯著增加［(18.63±10.20)ng/mL，P＜0.05］。見圖3。

四、TAM對腫瘤細(xì)胞的殺傷功能

常規(guī)培養(yǎng)的RFP-BT-549細(xì)胞未觀察到凋亡現(xiàn)象;RFP-BT-549細(xì)胞與正常單核細(xì)胞共培養(yǎng)后，出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞;當(dāng)RFP-BT-549細(xì)胞與IL-4/IL-13誘導(dǎo)后的單核細(xì)胞共培養(yǎng)時，RFPBT-549細(xì)胞的凋亡率顯著降低(P＜0.001)。見圖4。

圖3 ELISA檢測單核細(xì)胞IL-10的分泌量

圖4 Hoechst染色觀察腫瘤細(xì)胞凋亡

討 論

TAM在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，可表現(xiàn)在多個環(huán)節(jié)，其中包括分泌多種生長因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長［6-7］;分泌多種蛋白酶，破壞腫瘤細(xì)胞周圍的基底膜，從而間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周圍組織侵襲［8-9］;分泌大量促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)血管生成的酶類，并可表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)-C和 VEGF-D，從而促進(jìn)腫瘤血管和淋巴管的生成［10-12］;與腫瘤化療耐藥性密切相關(guān)［13-14］。TAM已成為抗腫瘤治療的作用靶點，而TAM與腫瘤細(xì)胞相互作用機(jī)制也成為近年研究的熱點，但目前缺乏一種理想的TAM細(xì)胞模型?，F(xiàn)有研究手段主要利用商品化的人外周血單核白血病細(xì)胞株THP-1作為巨噬細(xì)胞分化的模型，在PMA及IL-4/IL-13的作用下可分化為具有M2表型的巨噬細(xì)胞，以作為TAM模型。在體外實驗中，將該TAM模型與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，研究其相互作用及機(jī)制［15-16］。然而，THP-1細(xì)胞是一種幼稚的單核白血病細(xì)胞，處于低分化狀態(tài)，并不具備人外周血單核細(xì)胞所具有的各項免疫學(xué)功能。雖然THP-1細(xì)胞在PMA及IL-4/IL-13的誘導(dǎo)下可呈現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞的表型，但在功能方面并不能模擬單核細(xì)胞來源的TAM，因此用其作為TAM模型并不能真正模擬腫瘤微環(huán)境中的TAM。

在本研究中，我們分離健康人外周血單核細(xì)胞，并利用FCM檢測分離純度。利用IL-4/IL-13刺激純化的單核細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其表面標(biāo)志物CD204、CD206表達(dá)明顯增高，IL-10的分泌量也顯著升高。CD204是巨噬細(xì)胞清道夫受體1(macrophage scavenger receptor 1，MSR1)，CD206是巨噬細(xì)胞甘露糖受體(macrophage mannose receptor，MMR);IL-10是一種抑制炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子，可下調(diào)巨噬細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ以及協(xié)同刺激分子CD80和CD86的表達(dá)，使其抗原呈遞能力降低，并可抑制巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子和化學(xué)因子，使其促炎癥能力降低［17］。通過經(jīng)典途徑激活的巨噬細(xì)胞(M1型巨噬細(xì)胞)低表達(dá)CD204和CD206，其IL-10的分泌量也較低。而在腫瘤微環(huán)境中各種因素的作用下，TAM高表達(dá) CD204和 CD206，并分泌較多的 IL-10［18-19］。本研究中，經(jīng)IL-4/IL-13誘導(dǎo)的單核細(xì)胞高表達(dá)CD204和CD206，其IL-10分泌量也顯著增高，呈現(xiàn)出TAM的表型。

與表型改變相比，TAM的功能改變同樣重要。TAM呈現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞的功能，失去了對腫瘤的殺傷能力。本研究結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞相比，IL-4/IL-13誘導(dǎo)的單核細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力顯著降低，從而證實其具有TAM的功能。據(jù)報道，人外周血單核細(xì)胞經(jīng)巨噬細(xì)胞集落刺激因子誘導(dǎo)5～7 d后再經(jīng)IL-4/IL-13誘導(dǎo)3 d可作為TAM模型［5］。本研究利用IL-4/IL-13誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞5 d后也可使其呈現(xiàn)TAM的表型和功能，與現(xiàn)有方法相比，縮減了步驟和時間，可操作性更強(qiáng)，但還需進(jìn)一步的實驗驗證該TAM模型的穩(wěn)定性和實用性，以便未來廣泛的應(yīng)用。

綜上所述，本研究已成功建立了TAM體外分化的細(xì)胞模型，與利用THP-1細(xì)胞建立的TAM模型相比，本研究利用人外周血單核細(xì)胞建立的TAM模型在表型及功能方面更能模擬腫瘤微環(huán)境中的TAM，可用于研究TAM與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用及其機(jī)制。

［1］Mantovani A，Sozzani S，Locati M，etal.Macrophage polarization:tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes［J］.Trends Immunol，2002，23(11):549-555.

［2］Leek RD，Lewis CE，Whitehouse R，etal.Association of macrophage infiltration with angiogenesis and prognosis in invasive breast carcinoma［J］.Cancer Res，1996，56(20):4625-4629.

［3］Nowicki A，Szenajch J，Ostrowska G，etal.Impaired tumor growth in colony-stimulating factor 1(CSF-1)-deficient，macrophage-deficient op/op mouse:evidence for a role of CSF-1-dependent macrophages in formation of tumor stroma［J］.Int J Cancer，1996，65(1):112-119.

［4］Priceman SJ，Sung JL，Shaposhnik Z，etal.Targeting distinct tumor-infiltrating myeloid cells by inhibiting CSF-1 receptor:combating tumor evasion of antiangiogenic therapy［J］.Blood，2010，115(7):1461-1471.

［5］Tjiu JW，Chen JS，Shun CT，etal.Tumorassociated macrophage-induced invasion and angiogenesis of human basal cell carcinoma cells by cyclooxygenase-2 induction［J］.J Invest Dermatol，2009，129(4):1016-1025.

［6］Byrne SN，Knox MC，Halliday GM.TGFbeta is responsible for skin tumour infiltration by macrophages enabling the tumours to escape immune destruction［J］.Immunol Cell Biol，2008，86(1):92-97.

［7］Zhou W，Bao S.Reciprocal supportive interplay between glioblastoma and tumor-associated macrophages［J］.Cancers(Basel)，2014，6(2):723-740.

［8］Hagemann T，Robinson SC，Schulz M，etal.Enhanced invasiveness of breast cancer cell lines upon co-cultivation with macrophages is due to TNF-alpha dependent up-regulation of matrix metalloproteases［J］.Carcinogenesis，2004，25(8):1543-1549.

［9］Goswami S，Sahai E，Wyckoff JB，etal.Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop［J］.Cancer Res，2005，65(12):5278-5283.

［10］Toge H，Inagaki T，Kojimoto Y，etal.Angiogenesis in renal cell carcinoma:the role of tumor-associated macrophages［J］.Int J Urol，2009，16(10):801-807.

［11］Riabov V，Gudima A，Wang N，etal.Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis［J］.Front Physiol，2014，5:75.

［12］Jeon BH，Jang C，Han J，etal.Profound but dysfunctional lymphangiogenesis via vascular endothelial growth factor ligands from CD11b+macrophages in advanced ovarian cancer［J］.Cancer Res，2008，68(4):1100-1109.

［13］Shree T，Olson OC，Elie BT，etal.Macrophages and cathepsin proteases blunt chemotherapeutic response in breast cancer［J］.Genes Dev，2011，25(23):2465-2479.

［14］Jinushi M，Chiba S，Yoshiyama H，etal.Tumorassociated macrophages regulate tumorigenicity and anticancer drug responses of cancer stem/initiating cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(30):12425-12430.

［15］Freytes DO，Kang JW，Marcos-Campos I，etal.Macrophages modulate the viability and growth of human mesenchymal stem cells［J］.J Cell Biochem，2013，114(1):220-229.

［16］Tjiu JW，Chen JS，Shun CT，etal.Tumorassociated macrophage-induced invasion and angiogenesis of human basal cell carcinoma cells by cyclooxygenase-2 induction［J］.J Invest Dermatol，2009，129(4):1016-1025.

［17］Ruffell B，Affara NI，Coussens LM.Differential macrophage programming in the tumor microenvironment［J］.Trends Immunol，2012，33(3):119-126.

［18］Werno C，Menrad H，Weigert A，etal.Knockout of HIF-1αin tumor-associated macrophages enhances M2 polarization and attenuates their pro-angiogenic responses［J］.Carcinogenesis，2010，31(10):1863-1872.

［19］Komohara Y，Ohnishi K，Kuratsu J，etal.Possible involvement of the M2 anti-inflammatory macrophage phenotype in growth of human gliomas［J］.J Pathol，2008，216(1):15-24.