劉梅珍，李恒，，楊春霞，吳保承，李會，龔勁松，史勁松，許正宏

1(江南大學 藥學院，江蘇 無錫，214122)

2(江蘇省生物活性制品加工工程技術研究中心，江蘇無錫，214122)

三羥基雄甾烯酮(3β，7α，15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮，7α，15α-diOH-DHEA)可合成多種甾體類激素，在醫(yī)藥工業(yè)中常作為重要的醫(yī)藥中間體［1］。但采用生物轉化法羥化去氫表雄酮(DHEA)合成三羥基雄甾烯酮的工藝，存在底物水溶性差問題，從而導致產物得率較低［2－3］。這是甾體類藥物微生物轉化生產遇到的一個關鍵問題。在生產和研究中，已有大量方法被用于減少底物不溶解所引起的傳質阻力。如在發(fā)酵液中直接加入表面活性劑、親水性有機溶劑或將甾體底物預溶于有機溶劑后再投入發(fā)酵液。然而，無論選擇哪種適用的溶劑，它們對微生物細胞的毒害作用都不可避免，這在很大程度上制約了底物投料量的增加［4－5］。如何減小溶劑對細胞的毒害作用是甾體生物轉化急需解決的難題。

固定化技術是工業(yè)生物催化領域的一項重要技術，具有提高催化劑的穩(wěn)定性、增加重復利用批次、并有利于提高細胞對底物和有機溶劑的耐受性以及便于產物的分離純化等優(yōu)勢。另外，固定化細胞容易回收重復利用，提高了單位利用率，降低了生產成本［6－7］。鑒于這些技術優(yōu)勢，盡管固定化操作過程會使酶活有所降低，但該技術在醫(yī)藥、化工、食品等領域仍然備受關注。因此，選擇合適的方法和材料制備固定化細胞，以提高生物酶的保留活性、操作穩(wěn)定性以及重復利用性，并將其用于DHEA的生物轉化具有廣泛的應用前景。據(jù)已有文獻資料，迄今為止，未見任何有關固定化亞麻刺盤孢霉(Colletotrichum lini)ST-1并用于生物轉化DHEA生成7α，15α-diOHDHEA的相關文獻報道。此文通過C.lini ST-1固定化方法和材料的選擇，進行了 C.lini ST-1轉化DHEA生成7α，15α-diOH-DHEA的固定化條件和轉化條件優(yōu)化以及批次轉化應用。

1 實驗部分

1.1 材料和設備

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

Colletotrichum lini ST-1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.6051。

種子培養(yǎng)基(g/L):酵母粉15，葡萄糖15，玉米漿3，豆餅粉10，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖15，酵母膏15，玉米漿3，pH自然。

1.1.2 試劑

DHEA與7α，15α-diOH-DHEA 由浙江仙居藥業(yè)提供;瓊脂、瓊脂糖、卡拉膠、明膠、聚乙烯醇(PVC)、SA、CaCl2、NaCl、NaH2PO4、乙酸乙酯等均為分析或化學純，乙腈為色譜級，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 主要設備

硅膠層析板、層析缸、恒流泵等;恒溫混勻儀MS-100，杭州奧盛儀器有限公司;85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;日立冷凍高速離心機CR22GⅡ;戴安Ultimate3000液相色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體的制備與收集

菌球制備與收集:調配不同的發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值，以及添加不同濃度的吐溫－80，滅菌后按不同的接種量接種 C.lini ST-1種子液，于30℃、220 r/min搖床上培養(yǎng)24 h。得到的菌球直徑均一的菌液，洗滌過濾便得干凈菌球。

菌液制備與收集:通過控制接種量、搖床轉速、培養(yǎng)基初始pH及添加玻璃珠等方法培養(yǎng)菌體，獲得在0.5 mm尺度內均一的菌液后，洗滌并離心收集得到濕菌體。

1.2.2 固定化C.lini ST-1的制備

交聯(lián):干凈菌球分別用體積分數(shù)為0.01%的戊二醛和京尼平固定1 min后過濾洗滌，備用。

瓊脂、瓊脂糖、卡拉膠、PVC包埋:按參考文獻［8］制備，其中瓊脂、瓊脂糖、卡拉膠、KCl濃度均為40 g/L，PVC 濃度為140 g/L。

明膠包埋:濕菌體與等體積的40 g/L明膠溶液混合均勻后，倒在平板中。4℃冷卻凝固后，切成邊長2 mm的小塊，于1%的戊二醛溶液中浸泡30 min，傾去戊二醛，洗滌數(shù)次后4℃儲存?zhèn)溆茫?］。

SA包埋:SA溶液與濕菌體等體積混合均勻，用恒流泵使混合物通過針頭擠壓制得固定化小球(d=3 mm)于緩慢攪拌的冰浴CaCl2溶液中。4℃固定3 h后，洗滌并過濾小球，于4℃儲存在PBS溶液(10 mmol/L，pH 6.5)中備用［10－12］。

1.2.3 固定化C.lini ST-1的DHEA轉化

C.lini ST-1的固定化條件優(yōu)化:取一定量不同濃度SA(或CaCl2)制備得到的固定化C.lini ST-1于250 mL搖瓶中，加入20 mL緩沖液，投入8 g/L(研究底物濃度與批次轉化對固定化細胞的影響時另定)DHEA，于搖床上轉化。

固定化C.lini ST-1轉化條件的優(yōu)化:采用單因素優(yōu)化方法，保持其他轉化條件不變，僅改變搖床轉速、轉化溫度、緩沖液pH或濃度、固定化細胞量，以及添加合適濃度金屬離子、助溶劑和不同濃度的DHEA，考察其對固定化細胞轉化 DHEA生成7α，15α-diOH-DHEA的影響。

固定化C.lini ST-1的批次轉化:分別投加不同濃度DHEA的轉化體系，于最適條件下分別轉化最佳時長后，過濾分離固定化細胞與轉化液。轉化液用于檢測產物的含量，固定化細胞則投入新的轉化體系中轉化。如此讓固定化細胞轉化5～7個批次。

底物、產物的含量檢測:按照參考文獻［13］制備HPLC樣品。HPLC條件與參考文獻［14］相同。

2 結果與分析

2.1 菌球與菌液的制備

本研究初步考慮采用交聯(lián)法和包埋法2種方法來考察其對C.lini ST-1的固定情況。C.lini ST-1在普通液體培養(yǎng)條件下，菌體自成球，最終形成含有大量顆粒的菌液(圖1-a)。而本實驗結果發(fā)現(xiàn)，在初始pH為4，添加10 g/L吐溫－80的條件下，可獲得直徑合適(d=2 mm)的菌球(圖1-b)，且菌球表面為毛絨狀，生理狀態(tài)良好。而添加適量玻璃珠可培養(yǎng)得到分散均勻的菌液(圖1-c)。

圖1 不同培養(yǎng)條件下的菌體形態(tài)Fig.1 Mycelial morphology under different culture conditions

2.2 交聯(lián)法

交聯(lián)劑戊二醛和京尼平交后的菌球，產物7α，15α-diOH-DHEA的得率分別為23.8%，6.2%，均低于對照(27.0%)。其中以京尼平為交聯(lián)劑時，固定的菌體產物得率大幅度下降。

隨后對戊二醛的濃度進行了優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)交聯(lián)固定后的菌體，產物的得率隨著戊二醛濃度(0，0.01%，0.04%，0.07%，0.1%)的增加而迅速下降，且在第2批次轉化時菌體已基本無轉化能力。推測這可能是由于交聯(lián)劑對菌絲體的毒害作用較大。因此隨后考慮選用其他固定化方法，如包埋法。

2.3 包埋法

2.3.1 包埋材料對產物得率的影響

不同包埋材料制得的固定化C.lini ST-1，轉化DHEA生成7α，15α-diOH-DHEA的結果如圖2所示。瓊脂糖和SA包埋的C.lini ST-1，產物得率明顯高于其他幾種材料，且與游離細胞轉化能力基本持平。但考慮到瓊脂糖價格貴、制得的固定化細胞機械強度不高，而SA無此缺點。因此，最終選取SA作為包埋材料。

圖2 不同包埋材料固定化細胞的產物得率比較Fig.2 The product yield of immobilized cells embedded in different materials

2.3.2 SA濃度對產物得率的影響

包埋劑SA的濃度是影響固定化細胞活力的重要因素之一。從圖3-a可以看出，隨SA濃度的提高，7α，15α-diOH-DHEA的產率有一定的提高;但當 SA濃度過高時，產率有一定下降，這可能是SA濃度越高，雖然固定化細胞的機械強度增加，但傳質受到相應阻礙。最終，選取30 g/L的SA作為后續(xù)研究。

2.3.3 CaCl2濃度對產物得率的影響

固定劑濃度是影響固定化細胞性能的另一個重要因素。在SA濃度為30 g/L的條件下，分別用不同濃度的 CaCl2溶液固化細胞，并將其用于轉化DHEA。實驗結果如圖3-b，CaCl2濃度對產物的得率影響較大，當CaCl2濃度為50 g/L時效果最佳。

圖3 SA和CaCl2濃度對產物得率的影響Fig.3 Effects of SA and CaCl2concentration onproduct yield

2.4 轉化溫度、轉速對產物得率的影響

用上述優(yōu)化的固定化條件制備得到的固定化C.lini ST-1，考察了轉化溫度和搖床轉速對其轉化DHEA生成7α，15α-diOH-DHEA的影響。由圖4可以看出，27℃時產物得率達到最高水平，因此轉化溫度選為27℃。對于轉速，產物得率在180 r/min(38.9%)時較 160 r/min(29.0%)和 220 r/min(26.0%)時高，因此最終選擇180 r/min作為后續(xù)轉化的轉速。

圖4 轉化溫度對產物得率的影響Fig.4 Effect of conversion temperature on product yield

2.5 緩沖液pH和濃度對產物得率的影響

從圖5可以看出，在pH 5～8的范圍內，pH對固定化細胞的產物得率無顯著影響，為此，后續(xù)實驗將pH選為6.5。隨后本研究還測定了不同濃度磷酸鈉緩沖液對轉化的影響。結果表明，緩沖液濃度為20 mmol/L時，固定化細胞的產物得率相對較高。

圖5 緩沖液pH對產物得率的影響Fig.5 Effect of buffer pH on product yield

2.6 固定化細胞量的優(yōu)化

轉化過程中所采用的固定化細胞量，影響整個體系對DHEA的轉化能力。本實驗考查了20 mL緩沖液體系中，固定化細胞添加量對產物得率的影響。由圖6可以看出，當固定化細胞質量為12 g時，產物得率達到最大值，約為52%。

圖6 固定化細胞量對產物得率的影響Fig.6 Effect of immobilized cell amount on the product yield

2.7 金屬離子對固定化C.lini ST-1轉化DHEA的影響

考慮到甾體化合物的生物羥化反應需要Fe2+與Fe3+的循環(huán)參與［15］，所以本實驗研究了幾種常用的金屬離子對固定化C.lini ST-1轉化DHEA的影響。結果顯示，F(xiàn)e2+對轉化產率表現(xiàn)出顯著的促進作用，其次是Zn2+，而Fe3+則具有一定的抑制效果(圖7-a)。據(jù)文獻報道，F(xiàn)e2+生物利用性要高于Fe3+，而且還可與超氧陰離子、過氧化氫等氧化因子反應生成反應性更強的羥基自由基，而Fe3+對菌體活力有顯著的抑制作用［16］。另外發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+在11 mmol/L時，產物得率達到最高值57.5%(圖7-b)。

圖7 金屬離子對產物得率的影響Fig.7 Effect of metal ion on product yield

2.8 助溶劑對固定化C.lini ST-1轉化DHEA的影響

親水性的醇類以及其他有機溶劑和表面活性劑，有利于增加甾體化合物的溶解性和改變生物催化劑的選擇性［4］。在本實驗考察的幾種溶劑中，丙三醇對固定化細胞的產物得率最為有利(圖8-a)。其后繼續(xù)考察了不同丙三醇濃度對固定化細胞轉化DHEA的影響，如圖8-b所示，在添加量為90 g/L時，產物得率為66.0%，較對照提高幅度為14.9%。

2.9 PEG對固定化C.lini ST-1轉化DHEA的影響

溶質排出法［17］是一種有效的通過造孔而增加傳質的方法。聚乙二醇(PEG)具有兩親性，可以作為SA固定化小球的致孔劑，且不同分子質量的PEG可以制得不同直徑的小孔［18］。因此，在本實驗中我們選取了PEG作為制孔劑以考察其對固定化細胞產物得率的影響。

由圖9-a可知，PEG400制孔的固定化細胞在轉化得率上表現(xiàn)一定優(yōu)勢，而其他分子質量的PEG化合物并無顯著影響;尤其分子質量超過400時產率開始逐步下降。分析原因可能為PEG400的分子質量比底物DHEA(分子質量288)和產物7α，15α-diOHDHEA(分子質量320)的分子質量大且最為接近，因

圖8 助溶劑對產物得率的影響Fig.8 Effect of co-solvent on product yield

圖9 PEG對產物得率的影響Fig.9 Effect of PEG on product yield

2.10 不同底物添加量下轉化時間對產物得率的影響

底物對菌體有一定的毒害作用，如何選取合適的底物濃度以獲得最大產物得率是實際生產中需要考慮的重要問題。另外，底物的濃度不同，轉化體系的得率與生產強度達到最大值所需的時長不同。所以接下來考察了不同底物添加量下轉化時間對產物得率的影響。由圖10-a可以看出，不同的底物濃度下，得率均隨時間的增加而增加，最后基本趨于平穩(wěn)，但達到最高值所需時間不同。DHEA質量濃度為6、8、10、12、14 g/L時固定化細胞得率達到最高值所需時間分別為:80 h(63.7%)、88 h(71.2%)、88 h(73.1%)、80 h(68.5%)和 80 h(61.1%)。而游離細胞在DHEA質量濃度為8、10 g/L時，均為64 h(48.3%，42.3%)。同時可以看出，DHEA在10 g/L內，隨著濃度的增加，固定化細胞的最大得率逐漸增加。但繼續(xù)加大底物濃度，菌體轉化DHEA生成目標產物的能力達到極限，且底物濃度越高，對菌體的毒害越大，從而最大得率降低［18］。

圖10 不同底物投料濃度下轉化時間對產物得率的影響Fig.10 Effects of time on product yield at different DHEA concentration

而體系的生產強度，則都是先增加，在達到一個極值后開始下降。因為在轉化初期，固定化細胞存在傳質阻力，所以生產強度偏低。隨著時間的延長，這種限制逐漸減除，生產強度也相應升高;后期則因產物的反饋抑制而下降。不同的底物投料濃度，所得極值不同，取得極值的時間點也不同。其中，底物為6、8 g/L時，生產強度均在40 h達到最高值，10 g/L為48 h，12 g/L 為64 h，14 g/L 為72 h(圖10-b)。

2.11 批次轉化

為此，本研究又進行了不同底物濃度下的批次轉化實驗，每批次的轉化時長為相應底物濃度下體系的生產強度取得最高值時的時長。由表1可知，隨著固定化細胞轉化批次的增加，產物的得率先增加后下降，第2批次時最高。固定化細胞經過適應期后，以及第1批次轉化時殘留在SA小球中的產物的釋放，使得第2批次的產物得率增加。而隨后則因為固定化細胞的衰亡和營養(yǎng)物質的缺失，得率隨之下降。固定化細胞轉化4個批次，底物濃度在10 g/L時最佳，其產能為1.09(g產物/g細胞)，是游離細胞0.37(g產物/g細胞)的3倍，且每批次得率均在42%以上，產量為24.1 g/L。該數(shù)據(jù)為Romanoa等人所報道產量的 4 倍［19］。

表1 不同底物投料濃度下的批次轉化Table 1 Batch conversion at different substrate feeding concentration

3 結論

經過方法和材料的篩選，選擇了適用、易操作的SA包埋法。通過固定化條件和固定化C.lini ST-1轉化 DHEA生成 7α，15α-diOH-DHEA的條件的優(yōu)化，得到最適的轉化條件。投加8 g/L DHEA，在最適條件下轉化65 h，產物得率為68.7%，較游離細胞(51.2%)提高34.2%。而在DHEA濃度為10 g/L時，產物得率高達73.1%，較游離細胞(42.3%)高72.8%。說明固定化細胞在一定程度上可以有效保護菌體，提高細胞對底物的耐受性。而且固定化細胞可重復利用4個批次，生產力為游離細胞的3倍。

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