趙磊，李思然，張鶴龑?zhuān)绿黻?yáng)，吳迪，王紅

(北京工商大學(xué)北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京，100048)

糖酯是糖與脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)而生成的一類(lèi)有機(jī)成分，以糖(單糖、二糖、多糖、衍生多元醇)作為親水基團(tuán)，脂肪酸作為親油基團(tuán)，表現(xiàn)出了良好的雙親性，是一種優(yōu)良的非離子表面活性劑［1］。糖酯因其高度的安全性和良好的表面活性等優(yōu)點(diǎn)，已相繼被世界糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織、歐盟、美國(guó)、日本和中國(guó)等國(guó)家和組織批準(zhǔn)作為食品添加劑和藥用輔料。糖酯可作為食品乳化劑、潤(rùn)濕與分散劑、食品質(zhì)地改良劑、保鮮殺菌劑、結(jié)晶調(diào)節(jié)劑和抗老化劑，在食品加工中具有廣泛用途［2］。其中，糖酯的抗菌功能符合了食品防腐劑抗菌性強(qiáng)、安全無(wú)毒、適用性廣、性能穩(wěn)定的發(fā)展趨勢(shì)，在開(kāi)發(fā)營(yíng)養(yǎng)更全面、更安全的多功能食品添加劑方面具有廣闊的前景。

關(guān)于糖酯抗菌性的研究有很多［3-10］，日本學(xué)者中山等報(bào)道，以硬脂酸和棕櫚酸為主要組成脂肪酸的蔗糖酯，對(duì)罐裝咖啡和罐裝年糕赤豆湯分離出來(lái)的6株平酸腐敗菌均有阻礙其增殖作用［3］。Ferrer等發(fā)現(xiàn)，6-O-月桂酸蔗糖酯和6’-O-月桂酸麥芽糖酯對(duì)枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌有抑制作用，而蔗糖月桂酸二酯和6-O-月桂酸葡萄糖酯對(duì)微生物則幾乎沒(méi)有抑菌效果［4］。劉巧瑜等報(bào)道，0.09%的麥芽糖月桂酸單酯和蔗糖月桂酸單酯可有效地抑制蠟樣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、嗜熱芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)［5］。已有研究表明，蔗糖酯對(duì)微生物有廣泛的抑制作用，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用強(qiáng)于革蘭氏陰性菌［6-7］，其作用機(jī)理可能與脂肪酸酯破壞微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物流出，或擾亂了與膜相關(guān)的呼吸鏈電子傳遞系統(tǒng)有關(guān)［8-10］。這類(lèi)具有防腐抗菌作用的非離子表面活性劑幾乎不受食品體系pH值的影響，并且安全易降解。然而，現(xiàn)有研究主要針對(duì)于各種細(xì)菌，有關(guān)糖酯抗真菌方面的研究較少，且糖酸組成對(duì)糖酯抗真菌活性的影響尚無(wú)詳細(xì)報(bào)道。

因此，本研究在查閱有關(guān)資料的基礎(chǔ)上，以糖(葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖)和脂肪酸(正癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸)為原料，以固定化脂肪酶(Novozym435)為催化劑，在非水相體系中進(jìn)行合成，產(chǎn)物通過(guò)分離純化，制備得到相應(yīng)的糖單酯。以草酸青霉、塔賓曲霉、卷枝毛霉及黑根霉4種真菌為供試菌種，進(jìn)行抗菌活性研究;從而為糖酯在果蔬采后保鮮和食品防腐劑領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;D-果糖，購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)公司;固定化脂肪酶(Novozym435)，購(gòu)自丹麥諾維信中國(guó)有限公司;PDA培養(yǎng)基，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;柱層析硅膠G(100～200目)、薄層色譜硅膠板G(100mm×200 mm，0.20～0.25 mm)，購(gòu)自青島海洋化工廠;草酸青霉(Penicilium oxalicum，GU078430)、塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis， FJ629356)、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides，F(xiàn)N650645)、黑根霉(Rhizopus nigricans)，北京工商大學(xué)食品發(fā)酵工程教研室惠贈(zèng);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HQ45恒溫?fù)u床，中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠;RV10控制型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司;HSC-12A氮吹儀，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司;SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司;ZWP-A1230恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司;Ci-L熒光顯微鏡，日本尼康株式會(huì)社。

1.3 糖酯的制備

采用丙酮作為反應(yīng)溶劑，糖100 mmol/L，糖酸比1∶3，4 ? 分子篩 70 g/L，脂肪酶(Novozym435)15 g/L，在45℃水浴振蕩反應(yīng)72 h，振蕩速度170～180 r/min。反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾除去分子篩、脂肪酶和未反應(yīng)的糖，上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。采用硅膠柱層析方法進(jìn)行純化(硅膠G 100～200目，柱12 mm×600 mm)，流動(dòng)相為乙酸乙酯-甲醇系統(tǒng)，流速為36 mL/h，按1管/5 min收集洗出液，并用TLC檢驗(yàn)、收集產(chǎn)物制備得到糖酯(單酯)。

1.4 糖酯抗菌作用的研究

1.4.1 孢子懸液的制備

用無(wú)菌接種環(huán)輕輕刮取表面的新鮮霉菌孢子至無(wú)菌PDA液體培養(yǎng)基中，加入玻璃珠振蕩1 h，濾去菌絲體，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，制成濃度為(0.8～1.2)×106孢子/mL的霉菌孢子懸液，備用。

1.4.2 濾紙片擴(kuò)散法［11］

按無(wú)菌操作的方式，培養(yǎng)皿中倒入10 mL PDA固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，吸取100 μL各類(lèi)霉菌孢子懸液于培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌涂布棒涂布均勻。將糖酯溶于無(wú)水乙醇中，配制成255 mmol/L的樣品溶液。吸取10 μL各樣品溶液于直徑為6 mm的濾紙片上，待乙醇揮發(fā)后，將濾紙片放置在已凝固并涂布有孢子懸液的PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)處理重復(fù)3次，同時(shí)做空白對(duì)照，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后觀察結(jié)果。采用十字交叉法測(cè)抑菌圈直徑，結(jié)果取平均值。通過(guò)測(cè)定抑菌圈的直徑來(lái)評(píng)價(jià)幾種糖酯的抗菌作用。

1.4.3 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定［12-13］

采用孢子懸液點(diǎn)接法測(cè)定糖酯的最小抑菌濃度。用倍比稀釋法將經(jīng)過(guò)初步篩選有較強(qiáng)抗菌作用的糖酯溶液稀釋成各種濃度，各培養(yǎng)皿內(nèi)加1 mL糖酯溶液和9 mL培養(yǎng)基，充分混勻使糖酯終濃度為0.63～20 mmol/L。待培養(yǎng)基冷卻后，于培養(yǎng)皿中央滴入10 μL孢子懸液，每個(gè)處理重復(fù)3次，同時(shí)做空白對(duì)照。經(jīng)以上處理的培養(yǎng)皿放在30℃下培養(yǎng)72 h后觀察菌落生長(zhǎng)情況，以不長(zhǎng)菌的最低濃度為該糖酯的MIC。用十字交叉法測(cè)量菌落直徑(mm)，計(jì)算抑菌率。

1.4.4 不同pH值條件下MIC的測(cè)定

首先配制 PDA培養(yǎng)基，用5%檸檬酸和1%NaOH 調(diào)整 pH 到 4.0、5.0、6.0、7.0 和 8.0［14］;然后121℃滅菌15 min，冷卻;用不同pH的培養(yǎng)基溶解糖酯樣品，制備得到不同濃度的糖酯溶液。并按照1.4.3的方法，分別測(cè)定不同pH條件下的最小抑菌濃度。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel軟件和SPSS軟件(13.0)進(jìn)行分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±S.D.)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾種糖酯對(duì)供試真菌的抗菌作用

幾種糖酯對(duì)供試真菌的抗菌作用見(jiàn)表1。由表中可知，幾種糖酯對(duì)4種供試真菌均具有抗菌作用，對(duì)草酸青霉和塔賓曲霉的抗菌作用顯著強(qiáng)于其他兩種真菌，其抗菌作用強(qiáng)弱順序?yàn)?草酸青霉＞塔賓曲霉＞卷枝毛霉 ≈ 黑根霉。以不同糖癸酸酯為研究對(duì)象，比較不同親水基團(tuán)(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和果糖)對(duì)糖酯抗菌作用的影響。結(jié)果表明，果糖作為親水基團(tuán)時(shí)，對(duì)草酸青霉和塔賓曲霉的抗菌作用最好，抑菌圈直徑分別為21.2 mm和15.8 mm。因此，選取果糖酯作為后續(xù)研究對(duì)象，比較不同親油基團(tuán)(癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸)對(duì)糖酯抗菌作用的影響。結(jié)果顯示，月桂酸作為親油基團(tuán)時(shí)，對(duì)供試霉菌的抗菌作用最好，對(duì)草酸青霉和塔賓曲霉的抑菌圈直徑分別達(dá)到22.7 mm和18.0 mm。果糖肉豆蔻酸酯和果糖棕櫚酸酯對(duì)4種供試真菌均無(wú)抗菌作用，推測(cè)其抗菌作用較差可能與溶解性較差有關(guān)。綜合分析表1中抗菌作用的結(jié)果，選取果糖月桂酸酯，以草酸青霉和塔賓曲霉作為供試菌，進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。

表1 幾種糖酯對(duì)供試真菌的抑菌圈直徑/mmTable 1 Inhibition zone diameter of several sugar fatty acid esters against tested fungi/mm

2.2 果糖月桂酸酯對(duì)供試真菌的抗菌效果及MIC的確定

2.2.1 MIC的確定

果糖月桂酸酯在pH4～8時(shí)對(duì)供試真菌的MIC，見(jiàn)表2和表3。果糖月桂酸酯對(duì)草酸青霉的MIC為1.25 mmol/L(pH5)、10 mmol/L(pH6)、10 mmol/L(pH7)和2.5 mmol/L(pH8);當(dāng)培養(yǎng)基pH為4時(shí)，在所選濃度范圍內(nèi)(0.63～20 mmol/L)，果糖月桂酸酯能夠完全抑制草酸青霉的生長(zhǎng)。果糖月桂酸酯對(duì)塔賓曲霉的 MIC為10 mmol/L(pH5)、10 mmol/L(pH6)、40 mmol/L(pH7)和 5 mmol/L(pH8);當(dāng)培養(yǎng)基pH為4時(shí)，在所選濃度范圍內(nèi)(2.5～40 mmol/L)，果糖月桂酸酯亦能夠完全抑制塔賓曲霉的生長(zhǎng)。由此看出，果糖月桂酸酯對(duì)草酸青霉和塔賓曲霉的抗菌活性有很大差異，草酸青霉對(duì)果糖癸酸酯的敏感性較強(qiáng)。此外，抗菌活性受pH值的影響較大，隨著pH值的升高呈先降低后升高的趨勢(shì)。

2.2.2 果糖月桂酸酯對(duì)供試真菌的抗菌效果

如表2和表3所示，果糖月桂酸酯除了對(duì)供試真菌的菌落直徑大小有影響，還影響菌落薄厚和產(chǎn)色素情況。對(duì)于草酸青霉，果糖月桂酸酯主要影響其菌落直徑，其次是菌落薄厚，而對(duì)產(chǎn)色素情況影響不大;通過(guò)比較抑菌率，研究pH值對(duì)果糖月桂酸酯抗菌活性的影響，發(fā)現(xiàn)在中性條件下的抗菌活性低于酸性和堿性條件，其強(qiáng)弱順序?yàn)?pH4＞pH5＞pH8＞pH7＞pH6。果糖月桂酸酯主要影響塔賓曲霉菌落直徑和產(chǎn)色素情況，而對(duì)其菌落薄厚影響不大;加入果糖月桂酸酯后，塔賓曲霉幾乎無(wú)黑色素分泌;通過(guò)比較抑菌率，研究不同pH值對(duì)塔賓曲霉抗菌活性的影響，其強(qiáng)弱順序依次為:pH4＞pH8＞pH5＞pH6＞pH7。

表2 不同濃度的果糖月桂酸酯對(duì)草酸青霉的抗菌效果Table 2 Antifungal effects of fructose monolaurate at different concentrations against Penicilium oxalicum

表3 不同濃度的果糖月桂酸酯對(duì)塔賓曲霉的抗菌效果Table 3 Antifungal effects of fructose monolaurate at different concentrations against Aspergillus tubingensis

目前，糖酯作為商品主要是蔗糖與硬脂酸、棕櫚酸和油酸的單酯、雙酯和三酯以及它們的混合酯。前期研究發(fā)現(xiàn)，果糖酯對(duì)食品中病原和腐敗細(xì)菌(如蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等)具有抗菌作用(數(shù)據(jù)未列出);本研究篩選得到的果糖月桂酸酯對(duì)引起食品腐敗的真菌(如，草酸青霉和塔賓曲霉)抗菌作用較強(qiáng)，用量為0.05%～1.45%(相當(dāng)于1.25～40 mmol/L)即可達(dá)到抗菌效果。此外，果糖酯在體內(nèi)可分解為果糖和脂肪酸而被機(jī)體利用。果糖在人體中的代謝途徑與胰島素?zé)o關(guān)，人體適量攝入不會(huì)引起血糖及胰島素水平波動(dòng)［15］。因此，果糖酯在一定程度上優(yōu)于蔗糖酯等傳統(tǒng)糖酯，將其單獨(dú)或與其他糖酯配伍使用，可獲得兼具乳化和防腐作用的多功能食品添加劑，在食品行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以脂肪酶作為催化劑，采用丙酮-分子篩體系進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)硅膠柱層析法分離純化制備得到了多種糖酯，并評(píng)價(jià)了它們?cè)诓煌琾H值條件下的抗真菌作用。結(jié)果表明，幾種糖酯對(duì)卷枝毛霉和黑根霉的作用均不明顯，但對(duì)草酸青霉和塔賓曲霉的抗菌作用較強(qiáng)，其中果糖月桂酸酯的抗菌作用最強(qiáng)。果糖月桂酸酯的抗菌活性受pH值影響較大，隨著pH值的升高呈先降低后升高的趨勢(shì)，在中性條件下的抗菌活性低于酸性和堿性條件。

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