廖 媛 陳亞瓊

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510630

肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma，簡稱肝癌或 HCC）占原發(fā)性肝癌的90%以上，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)分別位列第6位和第3位[1]。我國是肝癌的高發(fā)區(qū)，發(fā)病人數(shù)約占全球的54%[2]。由于肝癌的自然病程較長、起病隱匿，超過80%的肝癌在就診時已屬于中晚期，無法進(jìn)行根治性切除手術(shù)，療效欠佳、預(yù)后差[3-4]。機(jī)體免疫狀態(tài)對肝癌的療效和預(yù)后有重要影響[5]。正常情況下，機(jī)體的免疫監(jiān)控機(jī)制可消滅絕大多數(shù)異常的細(xì)胞。但極少數(shù)惡性細(xì)胞不僅在發(fā)生的過程中獲得了免疫逃逸的能力形成腫瘤，后者更可以在發(fā)展的過程中，通過多種手段來調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答來幫助自身的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[6]。淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成成分，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[7]。在腫瘤微環(huán)境中，既存在殺傷型免疫細(xì)胞，如NK細(xì)胞、CTL細(xì)胞等，它們能直接或通過分泌細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長；也存在某些調(diào)節(jié)性或抑制型免疫細(xì)胞，如Treg細(xì)胞等，它們非但不能清除腫瘤，反而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中抑制其他效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤作用。該文采用流式細(xì)胞術(shù)對69例中晚期肝癌患者外周血各淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行對比性研究，旨在探討中晚期肝癌患者細(xì)胞免疫功能的變化及意義。報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗對象、樣本采集和處理

肝癌患者外周血由中山大學(xué)腫瘤防治中心肝膽外科提供。實驗符合赫爾辛基宣言（The Declaration of Helsinki）的相關(guān)規(guī)定，所有患者均已簽署知情同意書并得到中山大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)[8]。肝細(xì)胞性肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)European Association for the Study of the Liver（EASL）的標(biāo)準(zhǔn)[9]。臨床腫瘤分期依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟制定的TNM分期（第6版）。所有患者治療前未接受任何抗腫瘤治療。20例健康人外周血由廣州市血液中心提供。

1.1.1 實驗組 從2011年6月—2012年5月期間，共收集中晚期（TNM III期）肝癌患者69例。其中男62例，女7例，年齡26～75歲，中位年齡50歲。

1.1.2 對照組 研究期間同時收集了28例早期（TNM I期）肝癌患者和20例健康人的外周血作為對照。其中早期肝癌患者，男27例，女1例，年齡32～69歲，中位年齡48歲；健康人，男17例，女3例，年齡25～55歲，中位年齡44歲。2個對照組與實驗組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

1.1.3 樣本采集和處理 所有入組病例于治療前2～3 d抽取清晨空腹外周靜脈血6 mL進(jìn)行分析。肝素抗凝管收集，收集后6 h內(nèi)進(jìn)行處理。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 實驗儀器 流式細(xì)胞儀為美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)，型號為FC500。

1.2.2 實驗試劑 流式細(xì)胞術(shù)熒光抗體：CD3-APC、CD3-ECD、CD4-FITC、CD4-PC7、CD8-PE、IFN-γ-PE 購自美國Beckman Coulter公司；CD3-FITC、CD56-PC7購自美國 BD公司；IL-17AAF647、FoxP3-APC購自美國eBioscience公司。IL-17固定破膜試劑盒（IntraPre Reagent）購自美國Beckman Coulter公司。FoxP3固定破膜試劑盒購自美國eBioscience公司。白細(xì)胞活化劑購自美國BD公司。Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自天津灝洋公司。

1.3 淋巴細(xì)胞亞群檢測

采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞。胞內(nèi)抗原IL-17和IFN-γ的檢測用白細(xì)胞活化劑刺激細(xì)胞4h之后進(jìn)行染色。 取50μL細(xì)胞（1×104/μL），加入適量的表面抗體，4 ℃避光孵育30min，PBS洗1次，離心（4 ℃，380 g，8 min），棄上清。胞內(nèi)抗原染色：加入50μL固定劑，室溫避光孵育15min，PBS洗一次，離心棄上清，加入50μL破膜劑，室溫避光孵育5 min，加入適量的胞內(nèi)抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗1次，離心棄上清，以500μLPBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀FC500檢測。核內(nèi)抗原FoxP3染色：加入400μL固定液，4℃避光孵育30 min，PBS洗1次，離心棄上清，加入1 mL通透液，離心棄上清，加入適量Foxp3-APC抗體，4℃避光孵育45 min，加入1 mL通透液，離心棄上清，以500μLPBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀FC500檢測。數(shù)據(jù)采用CXP analysis軟件分析。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，組間的均值差異學(xué)分析采用Mann-Whitney U檢驗。分類變量以頻數(shù)的形式表示，用χ2檢驗進(jìn)行對比分析。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 中晚期肝癌患者臨床特征

中晚期肝癌患者腫瘤負(fù)荷大、生長迅速，常伴有癌栓、腫瘤轉(zhuǎn)移等，有著與早期肝癌患者不同的特征。本研究中我們首先比較了不同分期肝癌患者的生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)相對早期肝癌患者，中晚期肝癌患者肝功能的多項指標(biāo)，如甲胎蛋白（AFP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）和乳酸脫氫酶（LDH）等均顯著上升；反映機(jī)體炎癥狀態(tài)的指標(biāo)，如外周血C-反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞總數(shù)（WBC）和中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值（NLR）也明顯升高，而外周血淋巴細(xì)胞數(shù)目卻有所下降，見表1。

2.2 中晚期肝癌外周血淋巴細(xì)胞表型

該研究利用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測了不同分期肝癌患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的比例。該研究首先通過檢測表面標(biāo)記對CD3+T、CD4+T、CD8+T、NK及NKT細(xì)胞進(jìn)行了分析，結(jié)果表明早期和中晚期肝癌患者外周血中上述淋巴細(xì)胞亞群比例均與健康人相當(dāng)。該研究進(jìn)一步通過檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子以及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子水平將CD4+T和CD8+T細(xì)胞分為不同的功能亞群：Th1（IFN-γ+/CD4+T）、Th17（IL-17+/CD4+T）、Treg（CD25+Foxp3+/CD4+）、和Tc1（IFN-γ+/CD8+T）。通過各組之間的比較我們發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，中晚期肝癌患者外周血Th1、Th17以及Treg比例顯著升高；與早期肝癌患者相比，中晚期肝癌患者外周血Th17細(xì)胞比例也明顯升高，而Tc1細(xì)胞比例卻顯著下降，Th1和Treg細(xì)胞則無明顯差異，見圖1。

表1 不同TNM分期肝癌患者臨床指標(biāo)對比

圖1 健康人和肝癌患者治療前外周血Th1、Th17、Treg和Tc1細(xì)胞亞群比例及比較

2.3 中晚期肝癌臨床指標(biāo)與免疫指標(biāo)相關(guān)性分析

腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移狀況與機(jī)體的免疫監(jiān)控狀態(tài)密切相關(guān)，而淋巴細(xì)胞亞群之間也可能存在相互促進(jìn)或抑制的關(guān)系。因此我們將治療前外周血炎癥指標(biāo)、淋巴細(xì)胞亞群比例和血漿細(xì)胞因子水平與臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①外周血中CRP（r=0.295，P=0.015）和 NLR（r=0.363，P=0.002）水平均與腫瘤大小呈正相關(guān)，而外周血淋巴細(xì)胞亞群比例CD3+T%（r=-0.260，P=0.031）、Th1%（r=-0.248，P=0.043）則與腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)；②CD3+T%（r=-0.283，P=0.019）、Th1%（r=-0.267，P=0.029）同時也與 AFP 呈負(fù)相關(guān)； ③CD4+T%（r=0.319，P=0.008）、Foxp3+/T%（r=0.275，P=0.026）與腫瘤血管侵犯呈正相關(guān)，CD8+%（r=-0.322，P=0.007）、NKT%（r=-0.263，P=0.029）則與腫瘤血管侵犯呈負(fù)相關(guān)；④WBC（r=0.337，P=0.005）、NLR（r=0.554，P=0.000）均與 CRP 呈正相關(guān)。

3 討論

隨著腫瘤的進(jìn)展，肝癌細(xì)胞會不斷增殖和侵襲，對正常肝細(xì)胞造成損傷，同時也會釋放一系列趨化因子、炎癥因子和生長因子，招募各種免疫細(xì)胞浸潤至腫瘤及周圍組織。該研究發(fā)現(xiàn)，中晚期肝癌患者外周血中一系列反應(yīng)機(jī)體炎癥水平的指標(biāo)如CRP、WBC、NLR都明顯高于早期肝癌患者，且伴隨多項反映肝功能損傷指標(biāo)的上升。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CRP、NLR水平均與腫瘤大小呈正相關(guān)，提示這種高水平的炎癥狀態(tài)可能有利于腫瘤的生長及侵襲。

既往的研究表明，肝癌患者體內(nèi)具有殺傷功能的CTL、NK等淋巴細(xì)胞的數(shù)目或功能被不同程度地下調(diào)或抑制[10]。該研究發(fā)現(xiàn)，與早期肝癌相比，中晚期肝癌外周血Tc1細(xì)胞比例顯著下降，這可能與腫瘤進(jìn)展過程中Tc1和Tc2平衡失調(diào)有關(guān)。

Treg細(xì)胞是一種重要的免疫抑制細(xì)胞，它可通過各種途徑抑制免疫反應(yīng)，介導(dǎo)免疫逃逸。Zhou[11]等在肝癌患者中發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞比例升高，且與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，但該研究未對不同分期肝癌患者Treg細(xì)胞的差異進(jìn)行比較。該研究發(fā)現(xiàn)，中晚期肝癌患者外周血Treg比例顯著高于健康人，且與腫瘤血管侵犯呈正相關(guān)，但不同分期肝癌患者外周血Treg細(xì)胞的比例并無顯著差異，提示Treg細(xì)胞在肝癌外周血中的升高，可能是腫瘤發(fā)生后對全身免疫狀態(tài)的影響造成的，是肝癌患者免疫失衡的表現(xiàn)，也是腫瘤發(fā)生的一個重要的潛在檢測指標(biāo)。

Th17細(xì)胞是一種新型的能產(chǎn)生IL-17A的CD4+T細(xì)胞，已被證實參與多種自身免疫疾病，但是目前對于其在腫瘤中的作用還存在爭議[12]。Zhang等[13]在肝癌中的研究發(fā)現(xiàn)，中晚期肝癌組織中IL-17A的表達(dá)水平高于早期肝癌，且與臨床預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。該研究發(fā)現(xiàn)，中晚期肝癌外周血Th17細(xì)胞比例顯著高于健康人及早期肝癌。但Zhang等[13]的報道卻發(fā)現(xiàn)，中晚期肝癌外周血Th17細(xì)胞與健康人及早期肝癌均無顯著差異，這可能與其中晚期肝癌組樣本量小有關(guān)。

上述淋巴細(xì)胞亞群的變化提示，肝癌在進(jìn)展過程中，能夠影響機(jī)體免疫平衡，使得免疫抑制型細(xì)胞占主導(dǎo)，從而幫助其生長侵襲。因此，中晚期肝癌除常規(guī)治療之外，可以針對患者免疫狀態(tài)采取相應(yīng)的免疫干預(yù)措施，從而提高治療效果，延長患者的生存時間。

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