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        夏枯草中熊果酸含量的UPLC測定

        2014-11-18 10:16:42謝文劍曹藝柏玉冰等
        中國當(dāng)代醫(yī)藥 2014年28期
        關(guān)鍵詞:夏枯草含量測定

        謝文劍+曹藝+柏玉冰等

        [摘要] 目的 建立夏枯草藥材中熊果酸含量的超高效液相色譜法(UPLC)測定方法。 方法 采用UPLC進(jìn)行測定,色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),以甲醇-0.5%冰乙酸水為流動相進(jìn)行等度洗脫,流速為0.3 ml/min,柱溫30℃,檢測波長210 nm。 結(jié)果 熊果酸在0.2461~0.4922 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r2=0.9999),平均回收率為99.29%,RSD=1.74%,熊果酸在夏枯草中的含量為0.28%~0.53%。 結(jié)論 該方法快速、高效、重現(xiàn)性好,可以為夏枯草藥材的質(zhì)量控制提供更有效的手段。

        [關(guān)鍵詞] 夏枯草;熊果酸;超高效液相色譜法;含量測定

        [中圖分類號] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721(2014)10(a)-0011-03

        夏枯草為唇形科植物夏枯草(Prunella vulgaris L.)的干燥成熟果穗,味辛、苦,性寒,具有清肝瀉火、明目、散結(jié)消腫之功效[1]。夏枯草的主要化學(xué)成分有三萜、黃酮、甾體、香豆素、蒽醌、苯丙素等[2]。其中的主要成分熊果酸具有鎮(zhèn)靜、抗?jié)?、降低血糖、抗炎、抗菌等多種生物學(xué)效應(yīng)[3-5]。近年來,又發(fā)現(xiàn)熊果酸具有抑制癌細(xì)胞增長、轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等作用,極有可能成為一種新型抗癌藥物[6-8]。另外,熊果酸還具有明顯的抗氧化功能,被廣泛用作醫(yī)藥和化妝品原料[9]。

        目前關(guān)于夏枯草藥材的質(zhì)量控制研究主要是以熊果酸、齊墩果酸和迷迭香酸等的HPLC含量測定和夏枯草藥材的HPLC指紋圖譜為主[10-14],關(guān)于夏枯草超高效液相色譜法(UPLC)含量測定的研究還未有報道,且相比于傳統(tǒng)的HPLC而言,UPLC具有柱效高、分離度好和分離快等優(yōu)點,大大縮短了樣品運行的時間,可以滿足當(dāng)下高通量分析的要求。因此,本實驗采用UPLC建立夏枯草藥材中熊果酸含量測定方法[15],測定不同批次的夏枯草藥材中熊果酸的含量,該方法靈敏度高,分離度好,重現(xiàn)性好,可以為夏枯草藥材的質(zhì)量控制提供更有效的手段。

        1 實驗材料

        1.1 儀器

        SK3300H型超聲波清洗器(上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司),T-214型電子分析天平(Denver公司),Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜系統(tǒng)、Empower工作站、四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、紫外檢測器(Waters 公司)。

        1.2 試劑

        甲醇(色譜純,Sigma公司),冰乙酸(色譜純,天津市化學(xué)試劑研究所),水為怡寶純凈水。對照品熊果酸為本課題組自制,純度>98%。

        1.3 材料

        15份夏枯草樣品均由廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司提供,經(jīng)中藥鑒定教研室龔力民老師鑒定為唇形科植物夏枯草。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),以甲醇-0.5%冰乙酸水(80∶20)為流動相系統(tǒng)進(jìn)行等度洗脫,檢測波長為210 nm,流速0.3 ml/min,柱溫30℃,進(jìn)樣量1 μl。

        2.2 對照品溶液的制備

        精密稱取熊果酸對照品10.70 mg,置于10 ml容量瓶中,加甲醇10 ml定容至刻度,密塞,搖勻,即得(每毫升對照品溶液含熊果酸1.07 mg)。

        2.3 供試品溶液的制備

        稱取夏枯草粉末約1.0 g,精密稱定,置于100 ml具塞錐形瓶中,加入甲醇10 ml,密塞超聲30 min,放冷至室溫,用甲醇補足重量,搖勻,0.22 μl微孔濾膜濾過,即得。

        2.4 線性關(guān)系考察

        精密吸取對照品溶液0.2、0.25、0.35、0.4、0.5 ml,分別置于1 ml容量瓶中,用甲醇定容,搖勻。分別取對照品溶液1 μl注入UPLC色譜儀,按上述色譜條件測定熊果酸峰面積積分值,以對照品峰面積積分值為縱坐標(biāo),對照品含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算熊果酸的回歸方程:Y=1.10×106X+6.93×104(r2=0.9997),線性范圍0.2461~0.4922 mg。

        2.5 方法學(xué)考察

        2.5.1 精密度實驗 取同一對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,進(jìn)樣體積1 μl,按上述色譜條件測定熊果酸峰面積積分值,計算峰面積的RSD=1.47%,表明本方法精密度良好,符合方法學(xué)考察要求。

        2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取同一對照品溶液,分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣,進(jìn)樣體積1 μl,按上述色譜條件測定熊果酸峰面積積分值,計算24 h內(nèi)峰面積的RSD=1.62%,表明熊果酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.5.3 重復(fù)性試驗 取同一批夏枯草樣品6份,每份約1.0 g,精密稱定,按上述供試品溶液的制備方法制備。取1 μl注入UPLC色譜儀,在上述色譜條件下測定熊果酸峰面積積分值,計算熊果酸峰面積的RSD=1.54%,表明熊果酸重復(fù)性良好。

        2.5.4 加樣回收率試驗 取已知熊果酸含量的夏枯草粉末6份,每份約0.5 g,精密稱定,分別加入熊果酸對照品適量,按上述供試品溶液制備方法制備。分別取樣品供試液1 μl注入UPLC色譜儀,測定熊果酸峰面積積分值,計算平均回收率為99.29%,RSD=1.74%,表明本方法加樣回收率良好(表1)。

        2.6 含量測定

        取不同批次的夏枯草樣品,每份約1.0 g,精密稱定,按上述供試品溶液制備方法制備。分別取樣品供試液1 μl注入UPLC色譜儀,測定熊果酸峰面積積分值,計算15份供試品溶液中熊果酸的含量(表2),對照品及樣品色譜圖見圖1。

        3 討論

        本實驗考察了甲醇、95%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇和50%乙醇6種不同提取溶劑,基于熊果酸峰面積確定了甲醇為提取溶劑。分別考察了10、15、20、25、30 ml五個體積,結(jié)果表明,提取溶劑體積為15 ml時,提取夏枯草樣品中熊果酸的效率最佳。比較超聲與回流兩種提取方法,超聲提取的效率要高于回流提取的提取率,故選擇超聲提取。分別考察不同超聲時間15、30、45、60 min,確定超聲時間為45 min。

        對夏枯草中化學(xué)成分研究表明,其所含的三萜酸類成分主要為熊果酸和齊墩果酸。兩者為同分異構(gòu)體,結(jié)構(gòu)極為相似,僅在C19和C20上有一個甲基位置的差異,給分離帶來一定難度,且熊果酸、齊墩果酸中無共軛體系,紫外吸收波長較短。在210 nm處,熊果酸的吸收峰靈敏度較高,其他色譜峰的干擾較小,分離最為理想,故選擇檢測波長為210 nm,測定熊果酸的含量。

        不同產(chǎn)地夏枯草中熊果酸的含量存在的差別較大,這可能是由于不同采集地點生長環(huán)境的不同,藥材的生長年限、采收季節(jié)、原產(chǎn)地加工也均存在差異。因此,應(yīng)注意有效成分含量的差別,嚴(yán)格規(guī)定夏枯草藥材的生長期、采收期,以保證臨床用藥的安全有效性。

        本研究所建立的夏枯草中有效成分熊果酸的含量測定方法快速、準(zhǔn)確,與傳統(tǒng)的HPLC測定方法相比,樣品的運行時間大大縮短,峰形與分離度均較好。

        [參考文獻(xiàn)]

        [1] 國家藥典委員會.中國藥典2010年版一部[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:263.

        [2] 王祝舉,趙玉英,涂光忠,等.夏枯草化學(xué)成分的研究[J].藥學(xué)學(xué)報,1999,34(9):679-681.

        [3] Liu J.Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid[J].J Ethnopharmacol,1995,49(2):57-68.

        [4] Checker R,Sandur SK,Sharma D,et al.Potent anti-inflammatory activity of ursolic acid,a triterpenoid antioxidant,is mediated through suppression of NF-κB,AP-1 and NF-AT[J].PLoS One,2012,7(2):e31318.

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        [6] Kuttan G,Pratheeshkumar P,Manu KA,et al.Inhibition of tumor progression by naturally occurring terpenoids[J].Pharm Biol,2011,49(10):995-1007.

        [7] Shanmugam MK,Dai X,Kumar AP,et al.Ursolic acid in cancer prevention and treatment:molecular targets,pharmacokinetics and clinical studies[J].Biochem Pharmacol,2013,85(11):1579-1587.

        [8] Zang L,Wu B,Lin Y,et al.Research progress of ursolic acid′s anti-tumor actions[J].Chin J Integr Med,2014,20(4):72-79.

        [9] Santiago LA,Dayrit KC,Correa PCB,et al.Comparison of antioxidant and free radical scavenging activity of triterpenes α-amyrin,oleanolic acid and ursolic acid[J].J Nat Prod,2014.[Epub ahead of print]

        [10] 許招懂,姚江雄,劉菊妍,等.夏枯草藥材 HPLC 指紋圖譜研究[J].中藥材,2012,35(8):1234-1237.

        [11] 秦雯,巴寅穎,張?zhí)m珍,等.不同產(chǎn)地夏枯草藥材HPLC特征圖譜[J].中華中醫(yī)藥雜志,2012,27(5):1418-1420.

        [12] 孫乙銘,徐建中,王志安,等.高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地的夏枯草中熊果酸含量[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(5):1125-1126.

        [13] 劉偉,丁海杰.HPLC測定夏枯草中熊果酸,齊墩果酸,迷迭香酸的含量[J].中成藥,2008,30(4):577-580.

        [14] 方羅,林能明,吳永江.高效液相色譜同時測定夏枯草藥材中4種活性成分的含量[J].中國中藥雜志,2010, 35(5):616-619.

        [15] 沈盼盼,謝曉梅,張圣龍,等.UPLC法測定宣木瓜中齊墩果酸、熊果酸[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2013,29(3):271-273.

        (收稿日期:2014-07-11 本文編輯:林利利)

        3 討論

        本實驗考察了甲醇、95%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇和50%乙醇6種不同提取溶劑,基于熊果酸峰面積確定了甲醇為提取溶劑。分別考察了10、15、20、25、30 ml五個體積,結(jié)果表明,提取溶劑體積為15 ml時,提取夏枯草樣品中熊果酸的效率最佳。比較超聲與回流兩種提取方法,超聲提取的效率要高于回流提取的提取率,故選擇超聲提取。分別考察不同超聲時間15、30、45、60 min,確定超聲時間為45 min。

        對夏枯草中化學(xué)成分研究表明,其所含的三萜酸類成分主要為熊果酸和齊墩果酸。兩者為同分異構(gòu)體,結(jié)構(gòu)極為相似,僅在C19和C20上有一個甲基位置的差異,給分離帶來一定難度,且熊果酸、齊墩果酸中無共軛體系,紫外吸收波長較短。在210 nm處,熊果酸的吸收峰靈敏度較高,其他色譜峰的干擾較小,分離最為理想,故選擇檢測波長為210 nm,測定熊果酸的含量。

        不同產(chǎn)地夏枯草中熊果酸的含量存在的差別較大,這可能是由于不同采集地點生長環(huán)境的不同,藥材的生長年限、采收季節(jié)、原產(chǎn)地加工也均存在差異。因此,應(yīng)注意有效成分含量的差別,嚴(yán)格規(guī)定夏枯草藥材的生長期、采收期,以保證臨床用藥的安全有效性。

        本研究所建立的夏枯草中有效成分熊果酸的含量測定方法快速、準(zhǔn)確,與傳統(tǒng)的HPLC測定方法相比,樣品的運行時間大大縮短,峰形與分離度均較好。

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        [14] 方羅,林能明,吳永江.高效液相色譜同時測定夏枯草藥材中4種活性成分的含量[J].中國中藥雜志,2010, 35(5):616-619.

        [15] 沈盼盼,謝曉梅,張圣龍,等.UPLC法測定宣木瓜中齊墩果酸、熊果酸[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2013,29(3):271-273.

        (收稿日期:2014-07-11 本文編輯:林利利)

        3 討論

        本實驗考察了甲醇、95%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇和50%乙醇6種不同提取溶劑,基于熊果酸峰面積確定了甲醇為提取溶劑。分別考察了10、15、20、25、30 ml五個體積,結(jié)果表明,提取溶劑體積為15 ml時,提取夏枯草樣品中熊果酸的效率最佳。比較超聲與回流兩種提取方法,超聲提取的效率要高于回流提取的提取率,故選擇超聲提取。分別考察不同超聲時間15、30、45、60 min,確定超聲時間為45 min。

        對夏枯草中化學(xué)成分研究表明,其所含的三萜酸類成分主要為熊果酸和齊墩果酸。兩者為同分異構(gòu)體,結(jié)構(gòu)極為相似,僅在C19和C20上有一個甲基位置的差異,給分離帶來一定難度,且熊果酸、齊墩果酸中無共軛體系,紫外吸收波長較短。在210 nm處,熊果酸的吸收峰靈敏度較高,其他色譜峰的干擾較小,分離最為理想,故選擇檢測波長為210 nm,測定熊果酸的含量。

        不同產(chǎn)地夏枯草中熊果酸的含量存在的差別較大,這可能是由于不同采集地點生長環(huán)境的不同,藥材的生長年限、采收季節(jié)、原產(chǎn)地加工也均存在差異。因此,應(yīng)注意有效成分含量的差別,嚴(yán)格規(guī)定夏枯草藥材的生長期、采收期,以保證臨床用藥的安全有效性。

        本研究所建立的夏枯草中有效成分熊果酸的含量測定方法快速、準(zhǔn)確,與傳統(tǒng)的HPLC測定方法相比,樣品的運行時間大大縮短,峰形與分離度均較好。

        [參考文獻(xiàn)]

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        [5] Nascimento PGG,Lemos TLG,Bizerra A,et al.Antibacterial and antioxidant activities of ursolic acid and derivatives[J].Molecules,2014,19(1):1317-1327.

        [6] Kuttan G,Pratheeshkumar P,Manu KA,et al.Inhibition of tumor progression by naturally occurring terpenoids[J].Pharm Biol,2011,49(10):995-1007.

        [7] Shanmugam MK,Dai X,Kumar AP,et al.Ursolic acid in cancer prevention and treatment:molecular targets,pharmacokinetics and clinical studies[J].Biochem Pharmacol,2013,85(11):1579-1587.

        [8] Zang L,Wu B,Lin Y,et al.Research progress of ursolic acid′s anti-tumor actions[J].Chin J Integr Med,2014,20(4):72-79.

        [9] Santiago LA,Dayrit KC,Correa PCB,et al.Comparison of antioxidant and free radical scavenging activity of triterpenes α-amyrin,oleanolic acid and ursolic acid[J].J Nat Prod,2014.[Epub ahead of print]

        [10] 許招懂,姚江雄,劉菊妍,等.夏枯草藥材 HPLC 指紋圖譜研究[J].中藥材,2012,35(8):1234-1237.

        [11] 秦雯,巴寅穎,張?zhí)m珍,等.不同產(chǎn)地夏枯草藥材HPLC特征圖譜[J].中華中醫(yī)藥雜志,2012,27(5):1418-1420.

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        [14] 方羅,林能明,吳永江.高效液相色譜同時測定夏枯草藥材中4種活性成分的含量[J].中國中藥雜志,2010, 35(5):616-619.

        [15] 沈盼盼,謝曉梅,張圣龍,等.UPLC法測定宣木瓜中齊墩果酸、熊果酸[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2013,29(3):271-273.

        (收稿日期:2014-07-11 本文編輯:林利利)

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