摘要：以陜南10種主栽黑木耳品種的營(yíng)養(yǎng)菌絲為材料進(jìn)行酯酶（EST）同工酶的分析。結(jié)果表明，供試的黑木耳菌株酶帶數(shù)為3～5條，且相對(duì)遷移率為0.615和0.510處的2條酶帶10個(gè)菌株都具有，其相似性在0.375～1.000之間。應(yīng)用NTSYS-pc軟件進(jìn)行聚類分析，耳91和耳268、耳238和耳913的相似性系數(shù)為1.000，表明其親緣較近；耳801和耳238、耳913、國(guó)興1號(hào)的相似性系數(shù)僅為0.375，表明耳801與其他3株菌種的親緣性關(guān)系均較遠(yuǎn)。研究結(jié)果為陜南黑木耳的親緣關(guān)系和遺傳育種研究奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黑木耳；栽培種；酯酶同工酶；陜南

中圖分類號(hào)： S646.603文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）09-0193-04

收稿日期：2014-07-16

基金項(xiàng)目：陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：2014K01-16-03）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃（編號(hào)：2012HBGC-20）。

作者簡(jiǎn)介：彭浩（1979—），男，陜西安康人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事微生物學(xué)及儀器分析的相關(guān)教學(xué)科研工作。Tel：（0916）2641863；E-mail：penghaooo@snut.edu.cn。

通信作者：陳文強(qiáng)，教授，碩士生導(dǎo)師，從事微生物資源開發(fā)保護(hù)及利用相關(guān)研究。Tel：（0916）2642832；E-mail：wenqiangc@126.com。同工酶（isoenzyme）是具有相同或相近生物化學(xué)催化功能而酶蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同的一類酶[1-3]。同工酶蛋白分子構(gòu)型的相似性可反映出生物種群間的親緣關(guān)系，在進(jìn)行種和種以下的分類時(shí)可以通過分析同工酶提供理論依據(jù)[4]。同工酶技術(shù)鑒定不同食用菌的方法與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法相比具有很大的優(yōu)勢(shì)，首先是省時(shí)省力，其次是準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)單[5-7]，在食用菌菌種鑒定和不同食用菌菌種間親緣關(guān)系的研究、食用菌誘變育種、食用菌雜交和種質(zhì)資源遺傳圖譜及連鎖群識(shí)別中均有著重要的地位，在食用菌育種研究領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用[8-10]。近年來，國(guó)內(nèi)胡國(guó)元等[11]、馮改靜[12]、楊立紅等[13]、張瑾等[14]分別以金針菇、平菇、香菇、白靈菇、灰樹花等不同食用菌為研究材料，進(jìn)行菌絲酯酶同工酶的研究，結(jié)果表明，酯酶同工酶標(biāo)記是對(duì)食用菌進(jìn)行遺傳分析或生化鑒定中的最適標(biāo)記手段之一。

黑木耳是我國(guó)傳統(tǒng)的食用菌商品之一，已有2 000多年的人工種植歷史。據(jù)統(tǒng)計(jì)，最近幾十年，中國(guó)的黑木耳產(chǎn)量一直位居世界第一，是我國(guó)出口食用菌的主要產(chǎn)品。黑木耳也是地處秦嶺腹地的陜南地區(qū)食用菌的主栽品種之一。近年來，在黑木耳種植過程當(dāng)中，一些栽培品種出現(xiàn)不同程度的退化、老化和變異，導(dǎo)致黑木耳栽培性狀和產(chǎn)量的不確定，主要表現(xiàn)在一些栽培菌株的生物學(xué)效率差別顯著，口感和形態(tài)特征也有很大差異，這些由退化導(dǎo)致的因素嚴(yán)重?fù)p害了當(dāng)?shù)毓睫r(nóng)的利益。研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)原始菌株在連續(xù)傳種傳代10代后，其產(chǎn)量下降最多可達(dá)30%[15-16]。大多數(shù)種植區(qū)對(duì)黑木耳菌株管理存在很多缺陷，導(dǎo)致同一菌株被冠以不同的品種代號(hào)，造成菌種、品種混亂。因此，開展黑木耳種質(zhì)資源研究，選育穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的黑木耳菌株勢(shì)在必行。

目前，陜南地區(qū)主栽黑木耳品種酯酶同工酶酶譜系統(tǒng)分析的相關(guān)研究報(bào)道甚少。本研究選取10株陜南地區(qū)栽培較為廣泛的黑木耳為材料進(jìn)行酯酶同工酶的分析。通過垂直板聚丙烯凝膠電泳，根據(jù)酯酶同工酶電泳譜圖繪制模式圖并分析酯酶同工酶的多樣性，計(jì)算菌株之間的相似性系數(shù)并構(gòu)建聚類分析圖，分析菌株之間的親緣關(guān)系，旨在對(duì)該地區(qū)主栽的黑木耳菌種進(jìn)行親緣關(guān)系的確定，以及為今后高產(chǎn)菌株的選育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種耳91、耳238、耳268、耳629、耳801、耳913、秦單3#、秦單4#、新科1號(hào)、國(guó)興1號(hào)等10株菌株由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2主要儀器超凈工作臺(tái)（SW-CJ-IF型，蘇州安泰生物科技公司），生化培養(yǎng)箱（5PX-250B5H-Ⅱ型，上海新苗生物科技有限公司），立式壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-50SⅡ型，上海博迅生物科技公司），電子天平（BSA8201型，北京賽多利斯生物科技公司），電泳儀（DY-11型，北京六一生物科技有限公司），掃描儀（V330E型，上海愛普生生物科技有限公司）。

1.1.3主要藥品和試劑葡萄糖，瓊脂，蛋白胨，75%乙醇，KH2PO4，MgSO4·7H2O，維生素B1，丙酮，36%醋酸，超純水，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，堅(jiān)牢藍(lán)，α-乙酸萘酯，β-乙酸萘酯，蔗糖，阿魏酸。

1.1.4培養(yǎng)基CPDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯20.0 g，葡萄糖 2.0 g，瓊脂2.0 g，KH2PO4 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，維生素B1 1.0 mg，水100.0 mL，pH值自然。

樣品制備液體培養(yǎng)基：洋蔥20.0 g，蔗糖1.0 g，阿魏酸 6.0 mg，水100.0 mL，pH值自然。

1.2方法

1.2.1樣品制備三角瓶分別裝入樣品制備液體培養(yǎng)基 80 mL，接入供試菌株菌絲，在生化培養(yǎng)箱中25 ℃下靜置培養(yǎng)20 d。將靜置培養(yǎng)20 d后的樣品過濾，用純凈水反復(fù)多次沖洗菌絲體，用干凈濾紙吸干水分。分別稱取1.0 g黑木耳菌絲體分裝于2.5 mL的離心管中，在4 ℃下8 000 r/min冷凍離心20 min，上清液棄掉。再往2.5 mL的離心管中加入 2.0 mL、pH值6.8的Tris-HCL緩沖液和1.0 g石英砂，在冰浴下研磨，再次在4 ℃下8 000 r/min冷凍離心20 min，取上清液置于4 ℃冰箱保藏，備用。

1.2.2電泳及染色采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳法。濃縮膠濃度5.0%，分離膠濃度12.0%；電極緩沖液為Tris-Glycine系統(tǒng)，pH值8.3。上樣量20 μL，溴酚藍(lán)指示劑1滴，在樣品上加1層10%的蔗糖；4 ℃下進(jìn)行電泳；濃縮膠電壓 80 V，分離膠電壓120 V，電泳4 h左右。采用α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯和堅(jiān)牢藍(lán)染色，緩沖液為0.1 mol/L pH值6.2的磷酸緩沖液。電泳結(jié)束后把凝膠轉(zhuǎn)移至配好的染色液中，25 ℃恒溫條件下染色，當(dāng)有褐色的酶帶出現(xiàn)時(shí)，停止染色，用超純水漂洗凝膠板。endprint

1.2.3數(shù)據(jù)記錄和分析圖像采集：將染色后的膠板平鋪放置在掃描儀掃描倉(cāng)內(nèi)進(jìn)行分別率為600 ppi的圖片掃描。

繪制酯酶同工酶模式圖：根據(jù)電泳譜圖以酶帶顏色和寬窄的差異，可將酶帶分為4級(jí)：顏色深而且酶帶寬的一級(jí)酶帶，顏色較深而且酶帶較寬的二級(jí)酶帶，顏色較淺而且酶帶較窄的三級(jí)酶帶，顏色很淺而且酶帶窄的四級(jí)酶帶。對(duì)酶帶進(jìn)行分類并繪制酯酶同工酶模式圖。

測(cè)量相對(duì)遷移率（Rf）：相對(duì)遷移率Rf=X/Y，X為點(diǎn)樣孔下沿到指示劑前沿的遷移距離，Y為點(diǎn)樣孔下沿到凝膠中酶帶的遷移距離。用直尺測(cè)量Rf時(shí)，以酶帶的中部位置為準(zhǔn)。

酶譜之間相似性系數(shù)（S）分析：S=2Nab/（Na+Nb）。式中Nab為Rf 值相同的酶帶數(shù)，Na和Nb分別為菌株a和菌株b各自的酶帶數(shù)。當(dāng)所比菌株的酶帶數(shù)相同且全部為共有時(shí)，S=1；當(dāng)所比物種沒有一條共有酶帶時(shí)，S=0。

聚類分析：根據(jù)凝膠在相同遷移率的位置上是否有條帶進(jìn)行分類，該位置上有酶帶記為1，無(wú)酶帶則記為0，并利用NTSYS-pc軟件進(jìn)行聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.110種黑木耳菌株的營(yíng)養(yǎng)菌絲酯酶同工酶酶譜分析

在分離膠濃度為12.0%、濃縮膠濃度為5.0%的電泳條件下對(duì)供試的10種黑木耳菌株的營(yíng)養(yǎng)菌絲進(jìn)行酯酶同工酶電泳，得到酯酶同工酶譜圖（圖1），依據(jù)酶譜中酶帶的差異繪制酯酶同工酶模式圖（圖2）。

圖1顯示，供試10種黑木耳菌株的酯酶同工酶活性都比較高。電泳譜圖中共出現(xiàn)36條酯酶同工酶譜帶，每一菌株的酶帶在2～5條之間，大多在3～5條之間。其中，耳629、耳801都出現(xiàn)5條酯酶同工酶譜帶，耳238、耳913和國(guó)興1號(hào)出現(xiàn)4條酯酶同工酶譜帶，耳91、耳268、秦單3#、新科1號(hào)出現(xiàn)3條酯酶同工酶譜帶，秦單4#最少，只有2條同工酶譜帶。10個(gè)黑木耳菌株出現(xiàn)10個(gè)不同酶譜類型，沒有相同的酶譜類型，其中耳91和耳268、耳238和耳913菌株的帶型基本相似。10個(gè)供試菌株在Rf值0.615和0.510處都有2個(gè)共有酶帶，這可能是黑木耳菌種的特征酶帶。

圖2顯示，10種黑木耳菌株都共有1個(gè)二級(jí)酶帶，耳629、國(guó)興1號(hào)和新科1號(hào)的二級(jí)酶帶最多，有2條；耳238、耳629和耳913不具有一級(jí)酶帶，只有新科1號(hào)有2條一級(jí)酶帶。

2.210種黑木耳菌株酯酶同工酶的Rf值比較

2.310種黑木耳菌株間酶譜聚類分析

2.3.110種黑木耳菌株酯酶同工酶酶譜相似系數(shù)（S）根據(jù)酶譜之間相似性系數(shù)（S）計(jì)算10種黑木耳菌株酯酶同工酶譜相似性系數(shù)（表2）。表210種黑木耳菌株酯酶同工酶酶譜的相似系數(shù)

菌株編號(hào)相似系數(shù)耳91耳238耳268耳629耳801耳913秦單3#秦單4#國(guó)興1號(hào)新科1號(hào)耳911.000耳2380.8751.000耳2681.0000.8751.000耳6290.7500.8750.7501.000耳8010.5000.3750.5000.5001.000耳9130.8751.0000.8750.8750.3751.000秦單3#0.7500.6250.7500.5000.5000.6251.000秦單4#0.8750.7500.8750.6250.6250.7500.8751.000國(guó)興1號(hào)0.6250.7500.6250.6250.3750.7500.8750.7501.000新科1號(hào)0.7500.6250.7500.7500.7500.6250.7500.8750.6251.000

表2顯示，10種黑木耳菌株的遺傳相似性系數(shù)在 0.375～1.000 之間，2個(gè)菌株間的相似系數(shù)越小，說明2個(gè)菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其中，耳801和耳238、耳913、國(guó)興1號(hào)的相似程度最低，相似系數(shù)僅為0.375；耳801和耳91、耳268相似系數(shù)為0.500，表明它們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；而耳91和耳268、耳238和耳913的相似系數(shù)為1.000，說明它們可能是來自同一物種，甚至是親緣關(guān)系密切的變異類型。

2.3.2聚類分析構(gòu)建10種黑木耳菌株聚類分析圖（圖3），結(jié)果表明，耳91和耳268、耳238和耳913的相似性系數(shù)大，說明它們之間親緣關(guān)系近；新科1號(hào)、秦單4#和秦單3#的

相似性系數(shù)較大，這3個(gè)菌株之間親緣關(guān)系較近；耳238和耳629的相似性較大，說明這2個(gè)菌株之間親緣關(guān)系比較近。耳801和耳238、耳913、國(guó)興1號(hào)的相似程度最低，說明耳801和耳238、耳913、國(guó)興1號(hào)的親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)，可作為黑木耳原生質(zhì)體制備、融合及再生的優(yōu)勢(shì)菌株，這一結(jié)果可為陜南地區(qū)黑木耳的遺傳育種奠定理論基礎(chǔ)。

3討論

本研究選用陜南10種黑木耳主栽菌株作為供試材料，經(jīng) 20 d 靜置液體培養(yǎng)后使酯酶同工酶的活性得到充分表達(dá)，通過對(duì)電泳條件進(jìn)行試驗(yàn)，最終確定分離膠濃度12.0%、濃縮膠濃度5.0%為電泳凝膠的最佳條件。為防止電泳過程中產(chǎn)生的熱量使樣品中同工酶變性失活，需將電泳槽放置在4 ℃恒溫環(huán)境下進(jìn)行，確保試驗(yàn)的順利和結(jié)果的準(zhǔn)確性。

10種黑木耳菌株酯酶同工酶酶帶的差異分析表明，耳801和耳913、耳238、國(guó)興1號(hào)菌株酶譜的差異性較大，表明它們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；而耳91和耳268、耳238和耳913的酶譜具有一定的相似性，說明這4株菌中兩兩菌株之間的關(guān)系密切，這與相似性系數(shù)分析的結(jié)果一致。

酯酶同工酶既是通過基因來表達(dá)的，也是基因在分子水平上的體現(xiàn)，菌種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近可從菌株基因型的差異程度來反映。Vaughan在1968年提出種間親緣關(guān)系可以用酶譜相似度進(jìn)行預(yù)判，不同菌株之間的相似系數(shù)越大，表明物種間有著較小的酶譜差異，親緣關(guān)系越近[17]，因此，對(duì)酯酶同工酶譜進(jìn)行相似性系數(shù)分析是十分必要的。從酶譜相似系數(shù)表中可以看出，10種黑木耳菌株相似系數(shù)在0.375～1.000之間，相似系數(shù)達(dá)到0.625以上的菌株共7株，42對(duì)。其中耳91和耳268、耳238和耳913的相似系數(shù)為1.000，說明菌株間的遺傳差異普遍存在于10種黑木耳菌株中，耳91和耳268、耳238和耳913可能源于同一種，甚至是親緣關(guān)系更為密切的變異類型。endprint

通過對(duì)陜南主栽的10種黑木耳菌株的胞內(nèi)酯酶同工酶進(jìn)行垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，分析電泳譜圖，計(jì)算菌株間的相似性系數(shù)，得出耳801和耳238、耳913、國(guó)興1號(hào)的親緣性關(guān)系較遠(yuǎn)，可作為原生質(zhì)體制備、融合及再生的優(yōu)勢(shì)菌株，這可為陜南當(dāng)?shù)馗弋a(chǎn)優(yōu)質(zhì)的黑木耳品種的遺傳育種奠定理論基礎(chǔ)。

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通過對(duì)陜南主栽的10種黑木耳菌株的胞內(nèi)酯酶同工酶進(jìn)行垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，分析電泳譜圖，計(jì)算菌株間的相似性系數(shù)，得出耳801和耳238、耳913、國(guó)興1號(hào)的親緣性關(guān)系較遠(yuǎn)，可作為原生質(zhì)體制備、融合及再生的優(yōu)勢(shì)菌株，這可為陜南當(dāng)?shù)馗弋a(chǎn)優(yōu)質(zhì)的黑木耳品種的遺傳育種奠定理論基礎(chǔ)。

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通過對(duì)陜南主栽的10種黑木耳菌株的胞內(nèi)酯酶同工酶進(jìn)行垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，分析電泳譜圖，計(jì)算菌株間的相似性系數(shù)，得出耳801和耳238、耳913、國(guó)興1號(hào)的親緣性關(guān)系較遠(yuǎn)，可作為原生質(zhì)體制備、融合及再生的優(yōu)勢(shì)菌株，這可為陜南當(dāng)?shù)馗弋a(chǎn)優(yōu)質(zhì)的黑木耳品種的遺傳育種奠定理論基礎(chǔ)。

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