郇志博 羅金輝
摘 要 分別使用土壤培養(yǎng)法和血細胞微核試驗測定多菌靈及其雜質(zhì)(2,3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羥基酚嗪)和代謝物(2-氨基苯并咪唑)對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性和遺傳毒性。結(jié)果表明:多菌靈、2,3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羥基酚嗪和2-氨基苯并咪唑?qū)Τ嘧訍蹌衮球? d的LC50分別為8.60、14.84、18.92和27.72 mg/kg干土,多菌靈對蚯蚓的毒性為中毒,其他3種化合物為低毒。微核試驗結(jié)果表明:多菌靈能明顯誘導(dǎo)赤子愛勝蚯蚓血細胞產(chǎn)生微核,并且隨著暴露劑量和暴露時間的延長微核率增加;其他3種物質(zhì)在測定劑量和測定時間下,微核率與空白對照差異不顯著。
關(guān)鍵詞 多菌靈 ;2,3-二氨基酚嗪 ;2-氨基-3-羥基酚嗪 ;2-氨基苯并咪唑 ;急性毒性 ;遺傳毒性
分類號 X171.5
多菌靈是一種內(nèi)吸性苯并咪唑類殺菌劑,常用于防治多種真菌性病害,如炭疽病、霜霉病、銹病、瘡痂病、褐斑病等,在果蔬、茶葉和觀賞植物上廣泛應(yīng)用[1]。中國年產(chǎn)多菌靈原藥超過1萬 t,占中國殺菌劑總量的1/4[2]。截止2012年7月, 中國共有857家農(nóng)藥廠登記各種多菌靈的單一及復(fù)配制劑,且多菌靈還是其他苯并咪唑類殺菌劑(如:苯菌靈、噻菌靈和托布津等)的活性成分和代謝產(chǎn)物[3],多菌靈降解速度緩慢,在土壤中培養(yǎng)250 d后,仍會有5%~13%的多菌靈殘存于土壤中[4],而且多菌靈在水果、蔬菜中殘留超標(biāo)的情況也時有發(fā)生[5-6]。
2012年1月,美國可口可樂公司和百事公司的橙汁產(chǎn)品檢出極少量殺菌劑多菌靈,由于多菌靈可疑的損傷遺傳物質(zhì)的作用,引起全球范圍的“果汁”恐慌[7]。2012年4月國際環(huán)保組織“綠色和平”調(diào)查北京、成都和??诘?個茶葉品牌,檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)18份茶葉有14份含有多菌靈等可能影響生育能力、胎兒發(fā)育或可能損害遺傳基因的殘留農(nóng)藥[8]。
20世紀(jì)80年代就有關(guān)于多菌靈的毒性報道,至90年代,多菌靈已被世界衛(wèi)生組織列為可疑的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。多菌靈的大鼠急性經(jīng)口LC50>15 000 mg/kg,經(jīng)皮LC50>2 000 mg/kg,小鼠口服LC50為5 000 mg/kg,按中國農(nóng)藥毒性分級標(biāo)準(zhǔn)屬于低毒殺菌劑[9]。但多菌靈是否具有遺傳毒性,眾說紛紜。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),長期大量喂食含多菌靈的飼料可以提高小鼠肝臟良、惡性腫瘤的發(fā)病率,且與給藥量有著明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系;另一些學(xué)者卻研究發(fā)現(xiàn),多菌靈可能不是一種致突變物,因為給大鼠喂食含1 000 mg/kg多菌靈的飼料4個月,結(jié)果顯示為陰性[9]。曹柳燕等[10]研究發(fā)現(xiàn),多菌靈的致癌性與雜質(zhì)2,3-二氨基酚嗪(DAP)和2-氨基-3-羥基酚嗪(HAP)有關(guān),通過改善多菌靈的生產(chǎn)工藝,可以減少雜質(zhì)含量,降低多菌靈的遺傳毒性;于功昌等[9]認為,多菌靈的致癌性與其代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(2-氨基苯并咪唑)有關(guān)。因此,弄清多菌靈是否具有遺傳毒性以及其遺傳毒性與雜質(zhì)和代謝物的關(guān)系,對保護消費者的健康和保障食品安全具有重要意義。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 供試動物和藥劑
赤子愛勝蚯蚓(Eisenia foetida)購自天津賈立明養(yǎng)殖公司,每條體重約200~300 mg,經(jīng)實驗室預(yù)培養(yǎng),環(huán)帶明顯、大小基本一致的健康成蚓,試驗前清腸24 h。
多菌靈、2,3-二氨基酚嗪(DAP)、2-氨基-3-羥基酚嗪(HAP)和2-氨基苯并咪唑標(biāo)準(zhǔn)品購自SIGMA公司。
1.1.2 試驗設(shè)備和條件
光學(xué)顯微鏡(YS100,尼康);光照培養(yǎng)箱(HPG-280B,哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)。
試驗用人工土壤由10%泥炭蘚、20%高嶺土、68%石英砂和2%碳酸鈣組成,充分混勻后待用。
1.2 方法
1.2.1 急性毒性試驗
參照劉偉等[11]的研究方法,先做預(yù)試驗,求出各種化合物對蚯蚓7 d全致死的最低濃度和全存活的最高濃度,在此范圍內(nèi)設(shè)置5個處理組,設(shè)立溶劑對照和空白對照,每個處理3個重復(fù),每個重復(fù)10條蚯蚓。先將丙酮配制的系列濃度的化合物與10 g人工土壤混勻,待丙酮充分揮發(fā)后,再與490 g人工土壤充分混勻,調(diào)節(jié)水分,使其含水量約為30%,然后放入蚯蚓,置于2 L燒杯中,用塑料薄膜封口,并用解剖針在薄膜上扎孔,置(20±1)℃、濕度80%~85%的培養(yǎng)箱中,400~800 Lx光強連續(xù)光照,于第7天倒出瓶內(nèi)土壤,記錄蚯蚓死亡數(shù)(用針輕觸蚯蚓尾部,蚯蚓無反應(yīng)則為死亡),及時清除死蚯蚓。根據(jù)蚯蚓7 d的死亡率,求出各個化合物對蚯蚓的急性毒性LC50值及95%置信限。
1.2.2 微核試驗
根據(jù)急性毒性試驗各個化合物的LC50值,設(shè)置多菌靈試驗濃度為0.4、1.2、3.6 mg/kg干土;2,3-二氨基酚嗪濃度、2-氨基-3-羥基酚嗪濃度為0.6、1.8、5.4 mg/kg干土;2-氨基苯并咪唑濃度為0.8、2.4、7.2 mg/kg干土。設(shè)置空白(水)對照、陽性對照(絲裂霉素)0.4 mg/kg干土,染毒方法同急性毒性試驗方法,于處理后的第7、14、21天取出蚯蚓,制備血細胞涂片并進行顯微觀察,每個處理設(shè)3個重復(fù),每個重復(fù)10條蚯蚓。
將染毒后的蚯蚓浸入蒸餾水中并逐滴加入濃度為95%酒精,使蚯蚓麻醉,然后用濾紙吸干多余液體,用小剪刀將蚯蚓的背部剪破后取血,迅速涂片,晾干,甲醇固定15 min,15% Giemsa染色液(用0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋,pH 6.8)染色15 min,用去離子水沖洗,電熱吹風(fēng)吹干,400倍顯微鏡觀察。每個重復(fù)取2條蚯蚓,每條蚯蚓制備1張涂片,每張涂片觀察約500個血細胞,記錄微核細胞數(shù)目,計算微核率,觀察結(jié)果以千分率表示。微核判斷標(biāo)準(zhǔn):位于有核血細胞胞漿中,與主核完全分開,呈圓形或橢圓形藍紫色顆粒,邊緣光滑,染色性質(zhì)與主核一致,大小為主核的1/3以下[12]。
1.2.3 數(shù)據(jù)處理
根據(jù)不同濃度下的死亡率,使用軟件SPSS16.0的Probit模型計算各個化合物對蚯蚓的急性毒性LC50值及95%置信限;微核率的結(jié)果表示為[平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)],使用SPSS的單因素方差分析法分析不同濃度處理區(qū)組間差異,若差異明顯,用SPSS的最小顯著極差法(LSD)進行多重比較。
2 結(jié)果與討論
2.1 4種物質(zhì)對蚯蚓的急性毒性
4種物質(zhì)土壤染毒后蚯蚓的中毒癥狀類似:低濃度下,體色變暗,卷曲、僵硬,生殖環(huán)腫脹,高濃度處理后蚯蚓背部出現(xiàn)水泡、滲血現(xiàn)象,隨著中毒時間延長,高濃度處理組蚯蚓滲血現(xiàn)象嚴(yán)重,生殖環(huán)潰爛,體節(jié)延長,蚯蚓尾部有斷節(jié)現(xiàn)象。
蚯蚓是評價化學(xué)農(nóng)藥安全性的一種重要的指示生物。目前中國劃定的農(nóng)藥對蚯蚓毒性等級標(biāo)準(zhǔn)為高毒(LC50≤1 mg/kg干土),中毒(1 mg/kg干土
2.2 微核試驗
表2數(shù)據(jù)表明,隨著多菌靈濃度的升高,在相同的染毒時間內(nèi),蚯蚓血細胞的微核率顯著性升高。在同一濃度下,隨著染毒時間的延長,蚯蚓血細胞的微核率也有所提高(P<0.05),空白對照和陽性對照的試驗結(jié)果表明試驗數(shù)據(jù)可信。通過400倍的顯微鏡觀察,多菌靈誘導(dǎo)的蚯蚓血細胞微核清晰可見(圖1)。表2、3和4表明,多菌靈的2種雜質(zhì)2,3-二氨基酚嗪(DAP)和2-氨基-3-羥基酚嗪(HAP)和1種代謝物2-氨基苯并咪唑?qū)︱球狙毎⒑说恼T導(dǎo)作用與空白對照相比差異不顯著(P>0.05),而且隨著處理時間的延長,其微核率與空白對照相比差異也不顯著(P>0.05)。
3 結(jié)論
微核是細胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用后,在有絲分裂過程中形成的落后染色體、染色體橋、染色斷片、環(huán)狀染色體等在末期以后形成的1個或幾個規(guī)則的次核。一般產(chǎn)生的微核數(shù)與外界誘變因子的強弱成正比,所以可用微核出現(xiàn)的千分率來評價污染物對生物遺傳物質(zhì)影響的程度,微核率已被國際誘變劑、致癌劑保護委員會推薦為檢查致癌劑、誘變劑常用的遺傳毒理方法之一[13]。
至于多菌靈誘導(dǎo)產(chǎn)生微核的機理,黎杰強等[13]通過蠶豆微核試驗發(fā)現(xiàn),多菌靈一是通過干擾有絲分裂過程中紡錘體的形成,引起細胞不能正常有絲分裂,致使一到數(shù)條染色體在有絲分裂后期不能進入細胞核,而單獨留在細胞質(zhì)中形成微核;二是多菌靈直接導(dǎo)致染色體斷裂和粘連。吳麗明等[14]通過對雄性小鼠生殖細胞的染色體觀察發(fā)現(xiàn),多菌靈能誘發(fā)小鼠精母細胞染色體畸變率增加,畸變的類型有形成染色體斷片、環(huán)狀四價體和鏈狀四價體等。
本研究表明:多菌靈對赤子愛勝蚯蚓的毒性等級為中毒,雜質(zhì)(2,3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羥基酚嗪)和代謝物(2-氨基苯并咪唑)對赤子愛勝蚯蚓為低毒;多菌靈能明顯誘導(dǎo)赤子愛勝蚯蚓血細胞產(chǎn)生微核,并且隨著暴露劑量和暴露時間的延長微核率增加,因此多菌靈是一種潛在的誘變劑和致癌劑;建議目前的食品安全風(fēng)險評估在關(guān)注農(nóng)藥殘留的急性毒性的同時,加強關(guān)注多菌靈類似農(nóng)藥的誘變作用和致癌作用;另外雜質(zhì)(2,3-二氨基酚嗪和2-氨基-3-羥基酚嗪)和代謝物(2-氨基苯并咪唑)對蚯蚓血細胞染色體畸變的誘導(dǎo)作用不明顯,因此多菌靈的致癌致畸作用可能與這幾種物質(zhì)無關(guān)。
參考文獻
[1] 張戈壁,陽廷密,王明召. 苯菌靈對香蕉灰紋病菌室內(nèi)毒力測定[J]. 廣西園藝,2004,15(2):25-26.
[2] 宋遠超,于功昌,王筱芬. 多菌靈生殖毒性研究進展[J]. 中國職業(yè)醫(yī)學(xué),2010,37(6):505-507.
[3] 郎 漫,李 平,蔡祖聰. 多菌靈在土壤中的降解及其生態(tài)環(huán)境效應(yīng)[J]. 農(nóng)藥,2012,51(1):8-10.
[4] 花日茂,岳永德. 苯并咪唑類殺菌劑在環(huán)境中的降解代謝[J]. 安徽農(nóng)學(xué)院學(xué)報,1991,18(1):84-86.
[5] 蔡 興,范寧云,孫 錦. 多菌靈在三種蔬菜中的降解研究[J]. 甘肅科技,2009,25(3):62-63.
[6] 陳銘學(xué),牟仁祥,吳 俐. 反相離子對高效液相色譜法測定蔬菜中多菌靈殘留量[J]. 分析試驗室,2005,24(11):54-56.
[7] 任海軍.百事“純果樂”橙汁中發(fā)現(xiàn)極少量殺菌劑[EB/OL]. http://news.xinhuanet.com/world/2012-01/15/c_111439597.htm, 2012-01-15/2014-09-26.
[8] 杭州網(wǎng). 調(diào)查報告顯示多款茶葉農(nóng)藥殘留超標(biāo)[EB/OL]. http://news.hangzhou.com.cn/gnxw/content/2012-04/
12/content_4148249.htm, 2012-04-12/2014-09-26.
[9] 于功昌,王筱芬. 多菌靈的毒理學(xué)研究進展[J]. 職業(yè)與健康,2008,24(17):1 834-1 835.
[10] 曹柳燕,陳關(guān)喜,馮建躍,等. 多菌靈原藥中2 個酚嗪類雜質(zhì)含量的高效液相色譜法測定[J]. 分析測試學(xué)報,2008,27 (4):412-414.
[11] 劉 偉,朱魯生,王 軍,等. 毒死蜱、馬拉硫磷和氰戊菊酯對赤子愛勝蚓(Eisenia foetida)的急性毒性[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報,2009(4):597-601.
[12] 陳志偉,李興華. 銅鎘單一及復(fù)合污染對蚯蚓血細胞微核的誘導(dǎo)[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2006,25(5):1 193-1 197.
[13] 黎杰強,黃海琳,李丹霞,等. 3種常用農(nóng)藥對蠶豆根尖細胞的遺傳毒性[J]. 華南師范大學(xué)學(xué)報,2008(1):112-117.
[14] 吳麗明,黃伯俊. 多菌靈對雄性小鼠生殖細胞染色體畸變的影響[J]. 衛(wèi)生毒理學(xué)雜志,1993,7(1):52-53.