宋彥顯，閔玉濤

(中州大學(xué)化工食品學(xué)院，鄭州450044)

中藥蒺藜，別名刺蒺藜、硬蒺藜、白蒺藜，有活血祛風(fēng)、平肝解郁、明目、止癢等功效。［1，2］蒺藜的主要生理活性成分為皂甙，有明顯的強(qiáng)壯及抗動(dòng)脈硬化作用。蘇聯(lián)及保加利亞用其總皂甙制劑治療動(dòng)脈硬化及提高性功能;我國(guó)用其全草開(kāi)發(fā)了相應(yīng)制劑“心腦舒通”，在防治心腦血管疾病與性功能減退癥方面顯示良好療效。［3，4］鑒于蒺藜皂甙在健身、抗疲勞方面的突出作用，它有望成為功能因子研究領(lǐng)域中的一顆新星。本實(shí)驗(yàn)在前人工作的基礎(chǔ)上對(duì)蒺藜皂甙的提取、分離、部分純化的工藝條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以期為醫(yī)藥和食品工業(yè)中新型功能因子的研究與開(kāi)發(fā)提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

蒺藜，購(gòu)于鄭州中藥城，經(jīng)專(zhuān)職藥劑師鑒定;LSA-20大孔樹(shù)脂，西安電力樹(shù)脂廠(chǎng)。

SP-2102PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;HH-S11-2型電熱恒溫水浴鍋，北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蒺藜皂甙的提取及分離

1.2.1.1 水提醇沉法

取粉碎至40目的蒺藜40g，加蒸餾水(固液比1∶10，W/V)回流提取3h，趁熱過(guò)濾，真空濃縮，以蒸餾水定容至 50mL，攪拌下緩慢加入95%乙醇425ml，濾去沉淀，真空濃縮至近干，硅藻土轉(zhuǎn)移，濾紙包裹，依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯索氏提取1h，再用正丁醇索氏提取3h。各提取組分分別濃縮，風(fēng)干，稱(chēng)重，計(jì)算各部分收率。做定性試驗(yàn)。

1.2.1.2 70%乙醇回流提取法

取粉碎至40目的蒺藜40g，70%乙醇(固液比1∶10，W/V)回流提取3h，趁熱抽濾，濾液真空濃縮至近干，浸膏硅藻土轉(zhuǎn)移，濾紙包裹，依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯索氏提取1h，再用正丁醇索氏提取3h，各提取組分分別濃縮，風(fēng)干，稱(chēng)重，計(jì)算各部分收率。做定性試驗(yàn)。

1.2.2 大孔吸附樹(shù)脂部分純化

將未使用過(guò)的大孔樹(shù)脂用乙醇浸泡一天活化，裝柱(柱內(nèi)徑2.6cm)，填料高度 18.1cm。用1%的NaOH約兩個(gè)床體洗滌，然后用1%的HCl洗滌。蒸餾水沖洗至中性，待用。

洗脫所用水及乙醇液體積可按床體的倍數(shù)添加，便于計(jì)算所需洗脫液體積。

正丁醇相濃縮至干，少量水溶，上柱，依次用蒸餾水和 20%，30%，40%，50%，55%，60%，65%，75%，80%，95%乙醇梯度洗脫，收集各組分，進(jìn)行泡沫實(shí)驗(yàn)和顏色反應(yīng)。將 40%，50%，55%，60%，65%乙醇洗脫液烘干稱(chēng)重。

1.3 產(chǎn)物表征［5］

1.3.1 定性實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 泡沫實(shí)驗(yàn)

取樣品水溶液2mL于小試管中，用力振搖1min，如產(chǎn)生多量泡沫，放置15min后泡沫減少不明顯，則證明含皂甙。另各取樣液1mL，一管加2mL 0.1MNaOH 溶液，另一管加2mL 0.1MHCl溶液，用力振搖1min，泡沫高度相近是三萜皂甙，加堿管明顯高于加酸管的是甾體皂甙。

1.3.1.2 顯色反應(yīng)

(1)醋酐-濃硫酸反應(yīng)

取少量皂甙樣品溶解于醋酐中，加入醋酐-濃硫酸試劑，能產(chǎn)生顏色變化，一般由黃色轉(zhuǎn)為紅色、紫色、藍(lán)色或綠色。如果是甾體皂甙，在顏色的變化中最后呈現(xiàn)綠色，而三萜皂甙只能轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色、紫色或藍(lán)色，不出現(xiàn)綠色。

(2)三氯乙酸反應(yīng)

甾體皂甙滴在紙上，滴三氯乙酸試劑，加熱至60℃，生成紅色漸變?yōu)樽仙?。同樣情況下，三萜皂甙必須加熱到100℃才顯色，也生成紅色漸轉(zhuǎn)為紫色。

(3)氯仿-濃硫酸反應(yīng)

少量皂甙樣品溶解于氯仿，加入濃硫酸后，在氯仿層呈現(xiàn)紅色或藍(lán)色，硫酸層有綠色熒光出現(xiàn)。

(4)冰醋酸-乙酰氯反應(yīng)

少量皂甙樣品溶解于冰醋酸中，加入乙酰氯數(shù)滴及氯化鋅結(jié)晶數(shù)粒，稍加熱，則呈現(xiàn)淡紅色或紫紅色。

(5)三氯化銻反應(yīng)

樣品醇溶液點(diǎn)于濾紙上，噴20%三氯化銻氯仿溶液(不含乙醇或水)，于60～70℃加熱，樣品斑點(diǎn)呈灰藍(lán)﹑藍(lán)﹑灰紫等顏色。

1.3.1.3 其它物質(zhì)定性檢驗(yàn)

(1)黃酮定性實(shí)驗(yàn)(鹽酸-鎂粉反應(yīng))

樣品溶解于甲醇或乙醇，加入少量鎂粉振搖，滴加幾滴濃鹽酸，1～2min內(nèi)(必要時(shí)微熱)即可出現(xiàn)顏色。多數(shù)顯紅色～紫紅色，少數(shù)顯紫色～藍(lán)色。

(2)鞣質(zhì)定性實(shí)驗(yàn)(三氯化鐵反應(yīng))

樣品液中滴入三氯化鐵溶液，縮合鞣質(zhì)呈綠色或綠黑色或沉淀，可水解鞣質(zhì)呈藍(lán)色或藍(lán)黑色并多有沉淀。

(3)糖類(lèi)檢測(cè)(α-萘酚反應(yīng))

取樣液約1mL，加入α-萘酚試劑3滴，混勻，沿管壁慢慢加入濃硫酸約1mL，小心豎起試管，使硫酸與樣液清楚地分為兩層。兩液面間有紫色環(huán)，說(shuō)明樣液中含糖。

1.3.2 薄層層析

以硅膠制成的分析板為固定相，以展開(kāi)劑作為展開(kāi)體系進(jìn)行薄層層析。用毛細(xì)管取樣液點(diǎn)樣，點(diǎn)樣原點(diǎn)距底邊約0.8cm，原點(diǎn)線(xiàn)距展開(kāi)前沿線(xiàn)約為6cm。在原點(diǎn)線(xiàn)上確定兩個(gè)點(diǎn)為點(diǎn)樣位置，邊點(diǎn)樣邊用吹風(fēng)機(jī)吹溶劑，防止樣點(diǎn)擴(kuò)散。吹干后將硅膠板置于已加入展開(kāi)劑的層析缸中展開(kāi)，待展開(kāi)至前沿線(xiàn)取出，再次吹干后放入碘盒中碘熏顯色，約2 min后取出，觀(guān)察分離情況。

1.3.3 紫外可見(jiàn)分光光度法

1.3.3.1 比色

0.0045g皂甙溶于40mL 80%甲醇液中(樣品濃度為0.112mg/mL)，分別移取 0mL，0.4mL，0.8mL，1.2mL，1.6mL，2.0mL 于試管中，各加 2.0mL 0.5%香草醛乙醇溶液、1.0mL72%硫酸溶液，加80%甲醇至6mL，波長(zhǎng)544nm處測(cè)吸光度。

1.3.3.2 紫外掃描

(1)大孔樹(shù)脂分離純化的蒺藜皂甙用無(wú)水乙醇溶，分別取 50μL，60μL，70μL，80μL，90μL 在 200 ～360nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以乙醇做空白。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒺藜皂甙的提取與初步分離研究

2.1.1 皂甙粗提方法的選擇

蒺藜中的主要化學(xué)成分有甾體皂甙、生物堿、黃酮、氨基酸等物質(zhì)。多數(shù)皂甙極性較大，一般可溶于水，易溶于熱水、稀醇，難溶于丙酮，幾乎不溶于石油醚、苯、乙醚等親脂性溶劑。

表1 水提醇沉法和70%乙醇法提取后樣品的收率(%)

石油醚和乙醚是親脂性有機(jī)溶劑，極性較小，只能溶解一些極性小的親脂性物質(zhì)，如脂溶性色素、油脂和蠟。乙醚可以溶解經(jīng)甲醇醇解作用得到的低分子酚類(lèi)物質(zhì)，這一類(lèi)型的天然物質(zhì)在蒺藜中所占的比例很小。乙酸乙酯的極性較大，除了溶解前兩者不溶的脂溶性物質(zhì)外，還可溶解黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)物質(zhì)。正丁醇極性更大，對(duì)組織細(xì)胞的穿透力更強(qiáng)，皂甙類(lèi)主要可能在這一組分發(fā)現(xiàn)，此外，還可溶解單寧及其它高極性雜質(zhì)。

由表1可看出，梯度提取中，其收率順序?yàn)?正丁醇＞乙酸乙酯＞乙醚＞石油醚。

通過(guò)比較兩種方法所得粗皂甙重量及收率，可知70%乙醇回流法所得皂甙量和收率均高于水提醇沉法，是較優(yōu)的提取方法。因?yàn)樗岱ㄔ诖汲吝@一步驟時(shí)，將部分皂甙也夾帶沉淀，造成損失。

2.1.2 初步提取分離中的定性檢測(cè)

對(duì)1.2.1.1索氏提取的各樣品做定性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 水提醇沉法所得樣品定性檢測(cè)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，正丁醇組分三種定性反應(yīng)都呈陽(yáng)性，說(shuō)明其中存在皂甙。乙醚和乙酸乙酯組分冰醋酸-乙酰氯反應(yīng)現(xiàn)象呈陰性，醋酐-濃硫酸、氯仿-濃硫酸反應(yīng)現(xiàn)象雖然呈陽(yáng)性，但不如正丁醇組分明顯，說(shuō)明乙醚相、乙酸乙酯相中也溶有少量皂甙。石油醚組分的定性反應(yīng)現(xiàn)象都呈陰性，表明皂甙在石油醚中幾乎不溶解。

對(duì)70%乙醇回流提取的樣品進(jìn)行定性檢測(cè)，得出的結(jié)果與水提醇沉的樣品相似。

另外，對(duì)各組分進(jìn)行鹽酸-鎂粉反應(yīng)及三氯化鐵反應(yīng)定性檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果:鹽酸-鎂粉反應(yīng)，乙酸乙酯組分明顯呈陽(yáng)性，說(shuō)明乙酸乙酯相中含較多黃酮，其它各相呈陰性，說(shuō)明各相中不含黃酮或含極少量黃酮;三氯化鐵反應(yīng)，各相均呈陽(yáng)性(三氯化鐵層呈綠色)，表明各相含酚類(lèi)物質(zhì)，只是含量有差別。

2.1.3 薄層分離

取索氏提取后的各相液體少量，用薄層層析板進(jìn)行分離分析。

乙醚相:展開(kāi)體系為氯仿-丙酮-甲醇，8∶2∶1，碘蒸氣熏顯色后，可顯出三個(gè)斑點(diǎn)。

乙酸乙酯相:展開(kāi)體系為氯仿-丙酮-甲醇，8∶2∶1，碘蒸氣熏顯色后，發(fā)現(xiàn)有單一的點(diǎn)，Rf=0.31;氯仿-乙酸乙酯 -乙酸，5∶5∶1，顯示有三個(gè)點(diǎn)，Rf1=0.18，Rf2=0.41，Rf3=0.61。

正丁醇相:展開(kāi)體系為乙酸乙酯-醋酸-水，8∶2∶1，點(diǎn)在原處，未跑開(kāi)，因展開(kāi)劑極性太低;展開(kāi)體系氯仿 -甲醇 -水，3∶1.5∶0.5，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，因其組分太多。

2.2 正丁醇組分大孔吸附樹(shù)脂分離

2.2.1 各濃度洗脫液洗脫出的物質(zhì)重量

將40%，50%，55%，60%，65%乙醇洗脫下的各組分定容至25mL，移液管取5mL于稱(chēng)量瓶中，烘干至恒重，稱(chēng)重，計(jì)算總物重。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各濃度洗脫液洗脫出的物質(zhì)重量(g)

固形物量的分布與洗脫液體積、流速及洗脫方式(梯度、平行)有密切關(guān)系。由表3可看出，隨洗脫液濃度的增加，洗脫出固形物的量反而減小。因每個(gè)濃度洗脫液體積均為兩個(gè)床體，在較低濃度時(shí)，皂甙已被分離出來(lái)。梯度洗脫時(shí)，此種現(xiàn)象必然發(fā)生。若為平行方式，相同體積洗脫液，高濃度洗脫出的物質(zhì)量應(yīng)多于低濃度。

2.2.2 定性檢測(cè)

對(duì)蒸餾水、不同濃度的乙醇洗脫所得各個(gè)組分定性檢驗(yàn)。

先用兩個(gè)床體的蒸餾水洗脫，將其中的糖和蛋白質(zhì)洗盡。跟蹤檢測(cè)，直到滴出的液體α-萘酚反應(yīng)現(xiàn)象呈陰性，才可判定其中不含糖。

對(duì)20%，30%乙醇洗脫液做泡沫試驗(yàn)，由于成分復(fù)雜，即便有皂甙純度也不高，無(wú)法得出肯定的結(jié)論。30%乙醇洗出的組分經(jīng)鹽酸-鎂粉反應(yīng)檢測(cè)，顯紫紅色，表明了黃酮的存在。

取40%，50%，55%，60%，65%乙醇洗脫液分別做定性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)均含皂甙。

80%，95%乙醇洗脫，皂甙定性試驗(yàn)呈陽(yáng)性，但顏色較弱，顯示含量偏低，估計(jì)是由于大部分皂甙已被洗脫出的緣故。

由此可斷定40%乙醇洗脫液中皂甙含量最高。

2.2.3 薄層分析

將收集的經(jīng)大孔樹(shù)脂部分純化過(guò)的皂甙樣品進(jìn)行薄層層析，展開(kāi)體系為氯仿-甲醇-水，65∶35∶10，結(jié)果如圖1所示。

圖1 大孔樹(shù)脂柱層析分離后的皂甙

從圖1中可看出僅有一個(gè)斑點(diǎn)，Rf=0.86，可知蒺藜皂甙經(jīng)大孔樹(shù)脂柱層析后得到進(jìn)一步純化。

3 結(jié)論

(1)通過(guò)測(cè)皂甙得率與濃度，將水提醇沉法與70%乙醇回流法比較，證實(shí)70%乙醇回流法皂甙的得率較高，是較優(yōu)的提取方法。

(2)經(jīng)大孔樹(shù)脂LSA-20純化，皂甙主要存在于40%，50%，55%，60%，65%乙醇洗脫液中，濃縮得較純的皂甙。用薄層分析證實(shí)皂甙得到了純化。

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