周 銳，孔 瓊，薛春麗，高維明，普麗波，尹艷玲

（1.開遠(yuǎn)市人民政府發(fā)展生物產(chǎn)業(yè)辦公室，云南開遠(yuǎn)661699；2.紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自661199）

金線蓮（Anoectochilus formosanus）是蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，主要產(chǎn)于中國(guó)、日本、印度等東南亞國(guó)家，中國(guó)主要分布于福建、廣東、廣西、浙江、云南、貴州等?。▍^(qū)）[1～2]，素有“神藥”、“鳥人參”等美稱，是中國(guó)傳統(tǒng)的珍貴藥材，具有降血糖、滋陰降火、消炎止痛、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗乳腺癌等療效[3～4]。由于其株型小巧，葉型美觀，葉脈金黃呈網(wǎng)狀排列，也是觀賞價(jià)值極高的室內(nèi)觀葉珍品。其生態(tài)分布較窄，主要生長(zhǎng)于高海拔地區(qū)的深山密林下或溪澗旁潮濕的草叢中，呈稀疏、零星分部，很少成片密生；且種子微小呈粉末狀，種胚發(fā)育不全，自然繁殖率低，加之人為肆意采挖，野生資源現(xiàn)已瀕臨枯竭，已不能滿足醫(yī)藥臨床的需要。

雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)金線蓮的資源分布、藥用價(jià)值、組織培養(yǎng)及其栽培技術(shù)等方面已經(jīng)作了大量的研究[2～10]，為金線蓮的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了參考。但在云南省關(guān)于金線蓮的組培快繁技術(shù)還未成熟，還不太穩(wěn)定。因此，文章采用云南屏邊野生金線蓮為試材，開展叢生芽誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)研究，對(duì)提供藥源和種苗具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

來(lái)源于云南省屏邊縣的野生金線蓮。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒處理

將外植體用洗衣粉溶液浸洗后用自來(lái)水沖洗數(shù)次，切取長(zhǎng)0.5～1.0 cm的莖尖、帶芽眼莖段作為接種材料，放入75%酒精消毒30 s，再用0.1%HgCl2溶液（或加入吐溫-80） 中消毒7～10 min，然后用無(wú)菌水清洗5次，置于無(wú)菌濾紙上待用。

1.2.2 叢生芽誘導(dǎo)及增殖

將消毒后的接種材料于超凈工作臺(tái)上切成0.5～1.0 cm莖尖或帶芽眼莖段（莖節(jié)） 接入培養(yǎng)基中，每個(gè)配方接種12瓶，每瓶接3個(gè)外植體。采用MS、1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行野生金線蓮叢生芽誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)配方篩選。誘導(dǎo)階段是基本培養(yǎng)基篩選，其配方為MS+6-BA（0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L），1/2MS+6-BA（0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L）；增殖階段培養(yǎng)基配方為誘導(dǎo)階段中的最佳培養(yǎng)基，主要是通過(guò)不同濃度的植物激素添加，對(duì)叢生芽誘導(dǎo)增殖情況進(jìn)行比較，具體配方見表3。繼代過(guò)程為將誘導(dǎo)階段培養(yǎng)出生長(zhǎng)良好的無(wú)菌苗接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 壯苗及生根

當(dāng)增殖苗長(zhǎng)至3～4節(jié)時(shí)，進(jìn)行壯苗及生根實(shí)驗(yàn)。其基本培養(yǎng)基為1/10MS+NAA 0.5 mg/L+0.05%活性炭[11]，添加香蕉泥、馬鈴薯汁、椰子汁3種天然有機(jī)物，觀察其對(duì)金線蓮幼苗生長(zhǎng)的影響。上述每種培養(yǎng)基均接入無(wú)根幼苗10株，重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)每株凈增加的葉片和發(fā)根數(shù)。

1.2.4 培養(yǎng)條件

整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程均采用固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含3%蔗糖、0.7%瓊脂，用0.1 M KOH將培養(yǎng)基pH值調(diào)為5.5～5.8。培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照時(shí)數(shù)為12 h/d，光照強(qiáng)度為1 000～1 500 Lx。30 d后觀察叢生芽或苗生長(zhǎng)情況。

1.2.5 煉苗移栽

選取植株長(zhǎng)勢(shì)基本一致，有2～4條根的試管苗于溫室內(nèi)按不同方法進(jìn)行煉苗。封口方式：瓶苗置于室溫下封口3 d，開蓋6 d（噴水保濕）；松口方式：瓶苗直接開蓋9 d（每3 d噴水保濕1次）。9 d后，取出植株，洗凈培養(yǎng)基，用多菌靈可濕性粉劑800倍液處理 10 min 后植入泥炭∶腐殖土∶珍珠巖=1∶1∶1 配比的基質(zhì)中，1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)成活率。其試驗(yàn)條件為遮蔭度50%的溫室，空氣相對(duì)濕度保持70%～80%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對(duì)外植體污染率的影響

針對(duì)不同消毒方法處理發(fā)現(xiàn)外植體在莖尖和莖節(jié)添加吐溫比不加吐溫時(shí)滅菌效果更徹底，可降低污染率。由表1可看出，添加吐溫可明顯降低金線蓮?fù)庵搀w的污染率，減少污染幅度達(dá)10%左右。

表1 不同消毒方法對(duì)外植體污染率的影響

2.2 適宜金線蓮叢生芽誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基

根據(jù)表2可知，12種誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)叢生芽誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)不同的培養(yǎng)基配方對(duì)金線蓮叢生芽誘導(dǎo)具有較大影響，其中1/2MS培養(yǎng)基優(yōu)于MS培養(yǎng)基，在1/2MS培養(yǎng)基中當(dāng)6-BA濃度為4.0 mg/L時(shí)，來(lái)自于莖節(jié)和莖尖的叢生芽增殖倍數(shù)達(dá)到最大，分別為1.2和0.8；且莖節(jié)誘導(dǎo)增殖率高于莖尖。當(dāng)金線蓮?fù)庵搀w在培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d時(shí)，莖尖的腋芽開始突出，并逐漸伸長(zhǎng)，25 d左右腋芽的基部又長(zhǎng)出新的腋芽，而一些帶芽眼的莖段在25 d時(shí)能形成叢生狀的小苗。因此適宜金線蓮叢生芽誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基配方為1/2MS+6-BA 4.0 mg/L，且選用莖節(jié)為誘導(dǎo)的外植體材料。

表2 30 d后不同培養(yǎng)基對(duì)叢生芽誘導(dǎo)影響

2.3 金線蓮叢生芽增殖試驗(yàn)

以1/2MS+6-BA 4.0 mg/L為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA和2，4-D（表3），觀察2種不同激素對(duì)金線蓮叢生芽的增殖誘導(dǎo)。當(dāng)NAA濃度為0.4 mg/L時(shí)，7 d后莖節(jié)的腋芽開始萌動(dòng)膨大，芽不斷伸展，逐漸形成主葉，極個(gè)別莖節(jié)上能誘導(dǎo)出2～3個(gè)不定芽，30 d后主芽長(zhǎng)為1.8 cm，其基部也能再生側(cè)芽。添加NAA的出芽率高于2，4-D處理的出芽率，平均高出2倍。而在添加2，4-D的培養(yǎng)基中，一般20 d后可肉眼觀察到黃白色的小芽，隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸轉(zhuǎn)為綠色，出芽率低。當(dāng)培養(yǎng)60 d后，增殖苗長(zhǎng)勢(shì)良好，不定芽較多。

表3 不同植物生長(zhǎng)激素對(duì)金線蓮芽增殖的影響

2.4 壯苗及生根

大量研究表明，較低濃度無(wú)機(jī)鹽的基本培養(yǎng)基能提高組培苗的生根或煉苗移栽的成活率。筆者以1/10MS+NAA 0.5 mg/L+0.05%活性炭為基本培養(yǎng)基，添加3種不同濃度的有機(jī)添加物，探討其對(duì)金線蓮組培苗壯苗生根的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表4），3種有機(jī)添加物均能讓金線蓮組培苗壯苗生根，香蕉泥的作用最大，椰子汁其次，最差為馬鈴薯汁；當(dāng)香蕉泥濃度為200 g/L時(shí)，組培苗的發(fā)根數(shù)和葉片數(shù)最多，苗長(zhǎng)勢(shì)良好。

表4 不同有機(jī)添加物對(duì)金線蓮壯苗生根的影響

2.5 煉苗移栽

在溫室內(nèi)采用松口和封口的煉苗方式對(duì)金線蓮生根苗進(jìn)行煉苗，從表5可以看出，不同的煉苗方法影響金線蓮移栽成活率，封口煉苗成活率低于松口煉苗成活率。

表5 不同煉苗方式對(duì)苗移栽成活率的影響

3 討論

獲得無(wú)菌系是組培試驗(yàn)的首要基礎(chǔ)。由于種植于室外的各種植物，其植株體內(nèi)外攜帶較多的真菌和細(xì)菌，以致無(wú)菌系建立時(shí)污染率較高，因此可適當(dāng)增加酒精和HgCl2滅菌時(shí)間或添加一些表面活性劑[6，12]，也可添加一些廣譜性抗生素（慶大霉素、鏈霉素、卡拉霉素） 或殺菌劑（多菌靈、甲基托布津） 等方法[13]，以提高無(wú)菌系建立的效率。試驗(yàn)中以野生金線蓮的莖段或莖尖為外植體，探討添加吐溫對(duì)滅菌效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)在HgCl2溶液中滴加吐溫時(shí)，可以提高外植體的滅菌效果，且莖段的滅菌效果高于莖尖。其具體處理過(guò)程：經(jīng)自來(lái)水沖洗后的莖節(jié)用75%酒精浸泡30 s后，再用0.1%HgCl2（100 mL中加1～2滴） 處理8 min時(shí)滅菌效果最好，此時(shí)污染率達(dá)11%，而莖尖的污染率為15%。

在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，基本培養(yǎng)基、激素種類及其濃度、有機(jī)添加物對(duì)植物叢生芽的誘導(dǎo)、增殖及其生根壯苗具有較大的影響。通過(guò)莖尖和帶芽眼莖段2種外植體的叢生芽誘導(dǎo)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在同一種培養(yǎng)基處理中，帶芽眼莖段的增殖倍數(shù)高于莖尖，因此金線蓮叢生芽誘導(dǎo)的適宜外植體為帶芽眼的莖段，這與宋麗莎[7]的結(jié)果相一致；在不同基本培養(yǎng)基處理中，1/2MS的培養(yǎng)效果優(yōu)于MS培養(yǎng)基，金線蓮叢生芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基配方為1/2MS+6-BA 4.0 mg/L。生長(zhǎng)素NAA或2，4-D的添加能顯著促進(jìn)叢生芽的增殖和生長(zhǎng)，NAA的效果優(yōu)于2，4-D，適宜叢生芽增殖的配方為1/2MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L。在壯苗生根階段，3種有機(jī)添加物能明顯改善金線蓮的生長(zhǎng)狀況，其中當(dāng)香蕉泥濃度為200 g/L時(shí)，組培苗的長(zhǎng)勢(shì)最好，這與前人的研究結(jié)果相符[8]，因此金線蓮的壯苗生根培養(yǎng)配方為1/10MS+NAA 0.5 mg/L+0.05%活性炭+200 g/L香蕉泥。

由于金線蓮組培苗是在人為控制的理想環(huán)境中培養(yǎng)，當(dāng)移栽到大田間種植時(shí)，需要進(jìn)行人工馴化，適宜的煉苗方法有利于提高金線蓮組培苗的移栽成活率[9～10]。筆者采用封口和松口2種方式對(duì)金線蓮組培苗進(jìn)行溫室內(nèi)鍛煉，其中松口的煉苗方式能提高移栽成活率。

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