陳 健，呂新勇，孫曉萍，陳春苗，周 軍，王振中，蕭 偉

(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇省企業(yè)院士工作站，江蘇連云港 222001)

偏頭痛是人類最常見的慢性疾病之一，其作用機(jī)制尚不明確。目前，對(duì)偏頭痛的研究分為3種學(xué)說(shuō)，尤以神經(jīng)源性炎癥學(xué)說(shuō)得到廣泛認(rèn)可［1－4］。腦部血管擴(kuò)張是引發(fā)偏頭痛的關(guān)鍵［5］，研究表明［6－9］，電刺激大鼠硬腦膜可以引起腦部三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)的激活，導(dǎo)致血流量增加，形成電刺激硬腦膜偏頭痛動(dòng)物模型。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene－related peptide，CGRP)和血管活性物質(zhì) P物質(zhì)，一直被視為偏頭痛發(fā)作時(shí)，神經(jīng)纖維釋放的重要的肽類物質(zhì)，其中CGRP為偏頭痛發(fā)作時(shí)腦及硬腦膜血管擴(kuò)張物質(zhì)，P物質(zhì)為主要鎮(zhèn)痛因子，二者參與發(fā)病機(jī)制的整個(gè)過(guò)程［10］。前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)作為一種炎癥因子，具有擴(kuò)張血管，增加血流量的作用，但對(duì)于其參與頭痛的發(fā)病機(jī)制研究，一直鮮有報(bào)道。Ebersberger等［11］通過(guò)對(duì)離體大鼠硬腦膜的順/逆電刺激及化學(xué)刺激發(fā)現(xiàn)，PGE2可以促進(jìn)腦膜傷害感受器激發(fā)而產(chǎn)生疼痛。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)于模型刺激參數(shù)的研究表明，刺激頻率是影響模型成功與否的關(guān)鍵因素［12］。實(shí)驗(yàn)前期，分別采用了20和3 Hz進(jìn)行預(yù)試，結(jié)果表明，頻率過(guò)大，易導(dǎo)致大鼠硬腦膜的擊穿，造成大鼠死亡;頻率過(guò)小，刺激時(shí)間相應(yīng)增加，延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)周期，同時(shí)降低造模的成功率。因此，本研究選擇刺激大鼠腦部上矢狀竇區(qū)硬腦膜，頻率6 Hz，刺激時(shí)間1 h，并在刺激0，15，30 min和1 h對(duì)大鼠進(jìn)行眼眶采血，1 h后取大鼠腦組織，通過(guò)對(duì)血漿和腦組織中CGRP、P物質(zhì)和PGE2檢測(cè)，確定電刺激過(guò)程中，大鼠外周靜脈血中CGRP、P物質(zhì)和PGE2釋放的動(dòng)態(tài)變化及全腦中含量差異。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

0.9%生理鹽水100 mL注射液(山東潔晶藥業(yè)有限公司，批號(hào):101111423)，異氟烷(山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào) 20110604)，水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20100304)，肝素鈉(效價(jià) ＞170 kU·g－1，上海 SCRC630071國(guó)藥集團(tuán))，義齒基托樹脂(Ⅱ型自凝型)每瓶100 mL(上海二醫(yī)張江生物材料有限公司，批號(hào):120409)，注射用青霉素鈉(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)L111102)。CGRP、P物質(zhì)和PGE2放免疫試劑盒(北京華英生物有限公司，生產(chǎn)批號(hào)20130610)。

r－911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀(中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司生產(chǎn))，68006雙臂腦立體定位儀，臺(tái)式牙科鉆(深圳市瑞沃德科技有限公司生產(chǎn))，Medlab－v/8c生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司)，BS224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，5804R Eppendorf冷凍離心機(jī)，MIDMARL 91805112氣體麻醉機(jī)。

1.2 動(dòng)物及分組處理

18只SD健康雄性大鼠，體質(zhì)量400～450 g，SPF級(jí)，遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK2010－0001。SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，即正常對(duì)照組、手術(shù)對(duì)照組和模型組。

除正常對(duì)照組大鼠外，其余大鼠ip給予1 mL青霉素鈉(80萬(wàn)單位/5 mL，0.9%生理鹽水配制)，ip給予10%水合氯醛麻醉。以大鼠腦部十字縫交叉點(diǎn)前4 mm和交叉點(diǎn)后6 mm，分別用臺(tái)式牙科鉆鉆開2個(gè)直徑約1 mm的圓孔，在上下2個(gè)圓孔中打入1 mm×3 mm圓頭螺釘，顱面干燥后，用齒科粉和義齒基托樹脂(Ⅱ型自凝型)將螺釘以及導(dǎo)線固定于大鼠顱骨表面，干凝后，涂撒青霉素，導(dǎo)線于皮外留出8 mm左右備用。術(shù)后2 d ip給予青霉素鈉。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.3 大鼠腦部電刺激及血樣、腦組織采集

術(shù)后第3天，模型組大鼠經(jīng)氣體麻醉機(jī)麻醉，行電壓3 V、頻率6 Hz、脈寬0.25 ms、時(shí)間1 h電刺激，并于刺激0，15和30 min以及1 h時(shí)進(jìn)行大鼠眼眶采血，用肝素管收集約1 mL全血，并置于冷凍離心機(jī)中進(jìn)行離心(4℃，2862×g離心10 min)，取上層血漿;1 h后取模型組大鼠腦組織，與血漿共同置于－20℃冰箱中保存。正常對(duì)照組和手術(shù)對(duì)照組大鼠麻醉后均在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取血和腦組織。

1.4 放射免疫法檢測(cè)CGRP、P物質(zhì)和PGE2含量

每1 mL血漿加2 mL冷丙酮(4℃)，混勻，4℃下2862×g離心20 min)。取上清加4 mL冷石油醚，混勻后再次離心。吸棄上相，下相用氮?dú)獯蹈珊蟾稍锩芊?，待測(cè)。取大小適宜的組織塊，立即稱重于煮沸的生理鹽水(1 mL)中煮沸3 min再加0.5 mL冰醋酸1 mol·L－1于勻漿器中勻漿提取，再用0.5 mL NaOH 1 mol·L－1中和，2862 × g 離心15 min。取上清液儲(chǔ)存于－20℃待測(cè)。使用r－911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀以及放射免疫試劑盒，對(duì)血漿及腦組織樣本進(jìn)行CGRP、P物質(zhì)和PGE2檢測(cè)。

1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果用±s表示，采用 SPSS10.7軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 電刺激上矢狀竇區(qū)硬腦膜對(duì)大鼠血漿及腦組織CGRP含量的影響

表1結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、手術(shù)對(duì)照組和模型組大鼠眼眶血漿中CGRP在各時(shí)間點(diǎn)含量無(wú)顯著性差異。正常對(duì)照組和手術(shù)對(duì)照組大鼠腦組織CGRP含量相近，相比模型組大鼠腦組織CGRP含量顯著上升(P＜0.05)。

2.2 電刺激上矢狀竇區(qū)硬腦膜對(duì)大鼠血漿及腦組織P物質(zhì)含量的影響

與手術(shù)對(duì)照組比較，正常對(duì)照組和模型組大鼠眼眶血漿中P物質(zhì)含量無(wú)顯著性差異;而在腦組織中，與手術(shù)對(duì)照組相比，模型組大鼠P物質(zhì)含量最低(P ＜0.05)(表2)。

2.3 電刺激上矢狀竇區(qū)硬腦膜對(duì)大鼠血漿及腦組織PGE2含量的影響

與手術(shù)對(duì)照組相比，正常對(duì)照組和模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血漿中PGE2含量均無(wú)顯著性差異;模型組大鼠腦組織中PGE2含量高于正常對(duì)照組和手術(shù)對(duì)照組大鼠，且與手術(shù)對(duì)照組相比，有顯著性差異(P ＜0.05)(表3)。

Tab.1 Content of calcitonin gene－related peptide(CGRP)in plasma and brain of rats with electrical stimulation of dura mater of superior sagittal sinus

Tab.2 Content of P substance in plasma and brain of rats with electrical stimulation of dura mater of superior sagittal sinus

Tab.3 Content of prostaglandin E2(PGE2)in plasma and brain of rats with electrical stimulation of dura mater of superior sagittal sinus

3 討論

本研究數(shù)據(jù)顯示，模型組大鼠靜脈血漿中CGRP、P物質(zhì)以及PGE2含量隨時(shí)間變化先上升后下降，腦組織中CGRP和 PGE2的含量最高，P物質(zhì)的含量最低，表明腦部電極植入術(shù)未對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。

軟腦膜與硬腦膜血管收縮舒張為痛覺信號(hào)傳輸?shù)膩?lái)源，三叉神經(jīng)為偏頭痛發(fā)作時(shí)疼痛傳入神經(jīng)。盡管引發(fā)疼痛的機(jī)制尚不完全清楚，但是已知很多化學(xué)物質(zhì)參與其中［13］，它們共同激活三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)引發(fā)疼痛，導(dǎo)致血管中神經(jīng)肽類和炎癥因子等的釋放，其中主要的神經(jīng)肽即為CGRP和P物質(zhì)。

外周血漿中P物質(zhì)產(chǎn)生的變化，根據(jù)Goadsby等［14］和 Zagami等［15］研究分別顯示，在電刺激貓的三叉神經(jīng)節(jié)時(shí)，P物質(zhì)可以增加釋放量，而刺激上矢狀竇區(qū)硬腦膜時(shí)，P物質(zhì)含量卻基本沒有改變。Edvinsson等［16］通過(guò)腦膜以及血管中P物質(zhì)釋放研究發(fā)現(xiàn)對(duì)軟腦膜的電刺激和化學(xué)刺激可以引起P物質(zhì)釋放。因此，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果綜合分析，在僅刺激硬腦膜時(shí)，外周血漿中P物質(zhì)釋放可能無(wú)法顯著性增加。

CGRP在外周血漿整個(gè)釋放過(guò)程中可能亦是如此。CGRP一直被認(rèn)為是偏頭痛病理生理學(xué)研究的基礎(chǔ)，是一種強(qiáng)有力的舒張血管的肽類物質(zhì)。根據(jù)對(duì)離體大鼠硬腦膜電刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明［14］，隨著腦部電刺激進(jìn)行，CGRP的釋放持續(xù)增加;對(duì)大鼠進(jìn)行三叉神經(jīng)節(jié)電刺激［17］，大鼠外周血中CGRP的含量也顯著增加。但董釗等［18］通過(guò)對(duì)大鼠上矢狀竇旁硬腦膜行電刺激后，進(jìn)行心臟取血，并對(duì)血漿中CGRP和P物質(zhì)采用放射免疫法檢測(cè)，結(jié)果電刺激降低大鼠血漿CGRP濃度，初步推測(cè)采血樣的時(shí)機(jī)可以影響測(cè)定結(jié)果。Vessei等［19］也通過(guò)對(duì)CGRP作用的研究分析發(fā)現(xiàn)，血樣的采集時(shí)間是影響檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵。本研究采用對(duì)大鼠腦部電刺激過(guò)程中，按不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠眼眶進(jìn)行連續(xù)采血，對(duì)血漿中CGRP、P物質(zhì)和PGE2的含量隨著刺激時(shí)間的不同，進(jìn)行含量變化檢測(cè)，避免了采血時(shí)機(jī)對(duì)物質(zhì)含量測(cè)定的影響。

Brain等［20］通過(guò)P物質(zhì)對(duì)CGRP血管舒張活性的調(diào)節(jié)研究發(fā)現(xiàn)，P物質(zhì)釋放變化可能影響CGRP的含量，升高的P物質(zhì)可以激活肥大細(xì)胞產(chǎn)生蛋白酶從而水解釋放的CGRP，達(dá)到降低腦部血管擴(kuò)張作用。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中，CGRP的含量顯著升高，P物質(zhì)的含量顯著降低，間接對(duì)這一推斷進(jìn)行了佐證。

Ebersberger等［11］通過(guò)電刺激離體大鼠硬腦膜首次發(fā)現(xiàn)，腦膜組織中PGE2的釋放，并根據(jù)其隨刺激時(shí)間的變化推斷PGE2需要在CGRP等神經(jīng)肽類物質(zhì)先釋放后，在組織中不斷積累達(dá)到一定濃度時(shí)才會(huì)分泌。Kress等［21］采用體外大鼠皮膚組織逆向神經(jīng)電刺激發(fā)現(xiàn)，PGE2的釋放依賴CGRP含量變化。因此，本研究在電刺激大鼠硬腦膜時(shí)，PGE2在血漿與腦組織中釋放可能受到CGRP含量影響。另外，史兆春［22］等采用電刺激大鼠三叉神經(jīng)節(jié)對(duì)PGE2的釋放進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在大鼠硬腦膜中發(fā)現(xiàn)PGE2的含量顯著增加。

臨床偏頭痛患者主要有腦部血管收縮舒張，痛覺過(guò)敏等癥狀。刺激動(dòng)物的硬腦膜可以出現(xiàn)類似的變化，因此常采用電或化學(xué)刺激腦膜組織建立偏頭痛模型［23］。偏頭痛發(fā)病機(jī)制研究表明，除了神經(jīng)肽類，炎癥因子以外，組胺、5－HT以及內(nèi)皮素等也共同參與頭痛的發(fā)生［24］。Akerman 等［25］對(duì)組胺在硬腦膜血管擴(kuò)張作用的研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠硬腦膜電刺激時(shí)，組胺可引發(fā)腦部中動(dòng)脈分支血管產(chǎn)生顯著性擴(kuò)張。另外，5－HT、內(nèi)皮素等也對(duì)大鼠硬腦膜血管的擴(kuò)張起到作用［26－27］。本研究結(jié)果表明，電刺激大鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜時(shí)，血漿中除了神經(jīng)肽類以及炎癥因子釋放外，組胺、5－HT和內(nèi)皮素等其他參與頭痛發(fā)生物質(zhì)可能占主導(dǎo)作用。

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