劉潤(rùn)吉 張榮波 李 明 劉麗娟 呼滿霞 王 靜 曹曉梅 郭天宇 張曉龍**

(1.安徽理工大學(xué),安徽淮南 232000；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100123；3.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局，哈爾濱 150001)

傳統(tǒng)形態(tài)分類方法用于日常物種鑒定，會(huì)出現(xiàn)表型可塑性和遺傳變異性引起的鑒定錯(cuò)誤、忽略隱存種、受限于個(gè)體發(fā)育階段和性別等4個(gè)明顯的局限性(Hebertetal.,2003)。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類的固有局限性、地球上多達(dá)1000萬(wàn)的龐大物種數(shù)量和不斷縮減的分類學(xué)家隊(duì)伍，預(yù)示著對(duì)一種新的分類方案的巨大需求。20世紀(jì)后半葉，遺傳物質(zhì)核酸登上了自然科學(xué)史的舞臺(tái)，人們對(duì)基因的認(rèn)識(shí)和操作水平突飛猛進(jìn)，系統(tǒng)分類學(xué)開始了以基因或基因產(chǎn)物解析物種演化歷史的新歷程。DNA測(cè)序和PCR問世后，對(duì)基因進(jìn)化速率的研究也幾乎同時(shí)展開(Zinneretal.,2009; 劉海龍，2009; Wangetal.,2011)。由于線粒體沒有內(nèi)含子，較少受到重組影響，且為單倍型遺傳模式，所以比細(xì)胞核基因更適合用作分類標(biāo)準(zhǔn)。線粒體12S和16S核糖體基因存在大量的插入和缺失現(xiàn)象，使序列比對(duì)陷入困境，制約了它們?cè)诜诸愔械膽?yīng)用。線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ基因(COⅠ)比其他線粒體基因擁有更多的系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)，COⅠ基因密碼子的第3位核苷酸表現(xiàn)出很高的堿基置換率，這使得COⅠ基因在分子進(jìn)化速率方面超出12S rDNA和16S rDNA兩倍之多(Hebertetal.,2003)。COⅠ基因的氨基酸序列變化率要比cytb和任何其他線粒體基因更慢一些，這使得COⅠ基因能夠提供更廣闊的有關(guān)系統(tǒng)發(fā)生的視角。2003年，加拿大生物學(xué)家Hebert在總結(jié)前人工作的基礎(chǔ)上，以加拿大37種蚊蟲、北美260種魚類、南美531種熱帶蝴蝶和87種蝙蝠為研究對(duì)象，提出以COⅠ基因?yàn)橹饕獦?biāo)準(zhǔn)基因的DNA條形碼技術(shù)。 (Hebertetal.,2003; Lecompteetal.,2008; Pereiraetal.,2010)。

目前DNA條形碼研究的重點(diǎn)是界定種內(nèi)種間遺傳差異和物種之間的變異范圍。在分析種內(nèi)種間差異閾值時(shí)，往往出現(xiàn)樣本量太少的情況，以致不能做出有效的統(tǒng)計(jì)分析，無法進(jìn)行精確評(píng)估(陳春生等，2012；馬英等，2012)。

鼠類是多種自然疫源性疾病的儲(chǔ)存宿主?？焖贉?zhǔn)確地鑒別鼠類，是防控疾病的關(guān)鍵。針對(duì)鼠類的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定十分依賴于對(duì)鼠類的頭骨、牙齒和外形的辨別，具有很強(qiáng)的專業(yè)性。本研究通過DNA條形碼技術(shù)，對(duì)黑瞎子島地區(qū)常見的2科3屬4種41只鼠類的序列進(jìn)行種內(nèi)種間遺傳距離的計(jì)算和聚類分析，以便積累鼠類條形碼數(shù)據(jù)，建立COⅠ基因條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

所用實(shí)驗(yàn)樣品為2011年在黑瞎子島地區(qū)采集的鼠類，形態(tài)學(xué)鑒定為：棕背Clethrionomysrufocanus5只，紅背C.rutilus8只，東方田鼠Microtusfortis28只，花鼠Eutamiassibiricus3只?，F(xiàn)場(chǎng)鑒定后，分離肝臟和脾臟組織，保存于-80℃。從GenBank和BOLD systems下載用于分析的其他條形碼序列，詳見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)樣本信息Tab.1 Information of samples in this research

1.2 基因組DNA提取

取鼠肝臟或脾臟組織20 mg，研磨均勻。用北京天根生物公司基因組DNA提取試劑盒，提取組織DNA，并保存于-20℃。

1.3 PCR反應(yīng)和序列測(cè)定

COⅠ基因擴(kuò)增所使用的通用引物為COⅠ-L(5′-ACTTCTGGGTGTCCAAAGAATCA-3′)和COⅠ-H(5′-CCTACTCRGCCATTTTACCTATG-3′)(Robinsetal.,2007)。在50 μL反應(yīng)體系中，Premix Taq(Takara)25 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，模板3 μL，去離子水20 μL。 PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。隨后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并送北京華大基因測(cè)序。

1.4 COⅠ序列分析和系統(tǒng)樹構(gòu)建

用Chromos軟件查看COⅠ基因序列峰圖，判斷峰圖質(zhì)量。用Clustal X軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)。校正后的COⅠ序列在NCBI上用BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)。用MEGA5.0軟件計(jì)算COⅠ序列的堿基組成?；贙imura-2-parameter模型計(jì)算種內(nèi)和種間遺傳距離，以鄰接法(Neighbour-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。最大簡(jiǎn)約法分析使用啟發(fā)式搜索，參數(shù)如下：1 000 逐步加入法隨機(jī)加入序列構(gòu)樹方法采用二等分再連接(Tree-bisection reconnection,TBR)，可靠性由1 000次自展分支檢驗(yàn)。鄰接法分析采用HKY85遺傳距離，自展檢驗(yàn)1 000次。

2 結(jié)果

2.1 41個(gè)鼠類標(biāo)本COⅠ基因擴(kuò)增結(jié)果

通過通用引物成功擴(kuò)增出41個(gè)鼠類標(biāo)本的COⅠ基因片段，大小約為750 bp。電泳結(jié)果未發(fā)現(xiàn)非特異性雜帶。通過測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證了擴(kuò)增結(jié)果。

2.2 COⅠ基因的BLAST比對(duì)結(jié)果

將41個(gè)鼠類樣本COⅠ基因序列同NCBI上鼠類條形碼序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，5只紅背被誤判為棕背，24只莫氏田鼠被誤判為東方田鼠，1只大林姬鼠被誤判為東方田鼠。其余樣本形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果和DNA條形碼比對(duì)結(jié)果一致。

2.3 種內(nèi)與種間遺傳距離

用MEGA5.0軟件，基于Kimura-2-parameter模型計(jì)算黑瞎子島地區(qū)41個(gè)鼠類標(biāo)本的平均種內(nèi)和種間遺傳距離，見表2。

表2 黑瞎子島地區(qū)鼠類兩兩比對(duì)的種間平均遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離Tab.2 Average intraspecific genetic distance and average interspecific genetic distance

注：棕背樣本數(shù)據(jù)來自BOLD systems數(shù)據(jù)庫(kù)
Note: TheC.rufocanussample date comes from BOLD systems

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以反映序列之間的真實(shí)距離。本研究利用黑瞎子島地區(qū)4種鼠類共41個(gè)COⅠ基因序列，連同BOLD systems和GenBank中的鼠類序列，用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1。聚類分析結(jié)果表明，黑瞎子島地區(qū)常見4種鼠類的同種個(gè)體聚為單獨(dú)的一支，同屬不同種的個(gè)體聚為更大的一支，同科不同屬的分支聚為一總支。

圖1 NJ法構(gòu)建的黑瞎子島地區(qū)常見鼠類分子系統(tǒng)樹Fig.1 NJ tree based on COⅠ gene fragments from 41 individuals of 4 rat species

3 討論

黑瞎子島地區(qū)41個(gè)鼠類樣本COⅠ基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)后，結(jié)果顯示，相似性在99%～100%。在對(duì)鼠類樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，花鼠樣本未能出現(xiàn)特異性條帶，推測(cè)原因可能是擴(kuò)增體系不完全合適，以后研究中將加以改善。

基于COⅠ基因DNA條形碼技術(shù)的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)之一是種間差異遠(yuǎn)大于種內(nèi)差異。Hebert等(2003)對(duì)GenBank中13 320個(gè)親緣關(guān)系很近的同屬物種的COⅠ序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明種內(nèi)差異大多小于1%，極少大于2%，而種間差異則高達(dá)11.3%。本研究中通過對(duì)黑瞎子島地區(qū)2科3屬4種41個(gè)鼠類個(gè)體COⅠ基因序列進(jìn)行分析，同一種鼠類不同個(gè)體的DNA條形碼序列差異很小，為0.003～0.008，平均為0.005；種間差異則很大，為0.108～0.346，平均為0.258。平均種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的51倍，完全符合Hebert所作出的關(guān)于DNA條形碼有效性的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

DNA條形碼技術(shù)鑒定物種時(shí)，種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離之間的分離程度十分重要，有效的鑒定意味著種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離沒有重疊(Aliabadianetal.,2009)。本研究對(duì)黑瞎子島地區(qū)常見的4種41個(gè)鼠類標(biāo)本的條形碼序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明4種鼠類的種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離沒有重疊區(qū)域，這些數(shù)據(jù)提示DNA條形碼為有效區(qū)分鼠類提供了可能的手段。

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分子鑒定是非常直觀的方法。NJP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析結(jié)果表明，不同種類的鼠位于不同的分支，不同種屬的鼠類區(qū)別明顯。每一個(gè)單系分支對(duì)應(yīng)一個(gè)特異的物種，節(jié)點(diǎn)支持率為100%。在分支長(zhǎng)度上，種間分支較長(zhǎng)，種內(nèi)分支則很短。本研究以實(shí)驗(yàn)所得的41個(gè)COⅠ序列和從NCBI和BOLD systems中得到的14個(gè)相關(guān)鼠類COⅠ序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，每種鼠類形成的獨(dú)立分支進(jìn)一步驗(yàn)證了DNA條形碼鑒定鼠類的有效性。

本研究以黑瞎子島地區(qū)41個(gè)鼠類個(gè)體為樣本，擴(kuò)增COⅠ基因，結(jié)合Genbank和BOLD systems中相關(guān)的鼠類COⅠ序列，計(jì)算種內(nèi)種間遺傳距離，并進(jìn)行序列聚類和系統(tǒng)發(fā)育分析，證明基于COⅠ基因的DNA條形碼技術(shù)不僅能夠方便、快捷、準(zhǔn)確的鑒定鼠類，糾正形態(tài)學(xué)鑒定中的失誤，而且還能很好的鑒別形態(tài)相近的近緣種。DNA條形碼技術(shù)必將在口岸檢驗(yàn)檢疫、保護(hù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全、保護(hù)生態(tài)安全方面發(fā)揮重大的作用。