韓 波，楊麗艷，張 艷，祝 波，婁大偉*

(1．中油吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院藥劑科，吉林長(zhǎng)春132021;2．中油吉林石化公司化肥廠，吉林吉林132021;3．吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022)

食用菌生物多糖是一種非特異性免疫增強(qiáng)劑和免疫激活劑，廣泛用于醫(yī)藥和保健食品，被稱為“生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑”．食用菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的由10個(gè)分子以上的單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的高分子多聚物，是一類可以控制細(xì)胞分裂分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和衰老的活性多糖［1-2］．杏鮑菇，又名刺芹側(cè)耳，是近年來(lái)開發(fā)栽培成功的集食用、藥用、食療于一體的珍稀食用菌新品種．杏鮑菇多糖是杏鮑菇水提物中一種活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗損傷、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫以及抑菌等作用［3-7］．

微波是指頻率為300 MHz～300 kMHz，波長(zhǎng)在1 m～1 mm之間的電磁波．通過(guò)微波來(lái)實(shí)現(xiàn)提取的方法稱為微波提取法．其原理是微波射線輻射于溶劑并透過(guò)細(xì)胞壁到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部，由于溶劑及細(xì)胞液吸收微波能，細(xì)胞內(nèi)部溫度升高，壓力增大，當(dāng)壓力超過(guò)細(xì)胞壁的承受能力時(shí)，細(xì)胞壁破裂，位于細(xì)胞內(nèi)部的有效成分從細(xì)胞中釋放出來(lái)，傳遞轉(zhuǎn)移到溶劑周圍被溶劑溶解［8］．本研究以杏鮑菇為實(shí)驗(yàn)材料，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化杏鮑菇多糖微波輔助提取的最佳工藝條件，并觀察其降血糖作用，為進(jìn)一步開發(fā)和利用杏鮑菇資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

1 試劑與儀器

杏鮑菇，市售;無(wú)水乙醇、苯酚、硫酸均為國(guó)產(chǎn)分析純;葡萄糖，標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)(長(zhǎng)春)藥品生物制品檢定所;生理鹽水，吉林康乃爾藥業(yè)有限公司批號(hào)20130910;腎上腺素，黑龍江肇東華富藥業(yè)有限責(zé)任公司批號(hào)20120928，用前用生理鹽水配成0．1%的溶液;格列本脲，鄭州荔諾生物科技發(fā)展有限公司批號(hào)20090314，用前用0．5%CMC配成2．5%的溶液．

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);725型紫外光柵分光光度計(jì)(山東高密彩虹分析儀器有限公司);LDZ-5-2低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);FA-2004分析天平(上海精細(xì)科技儀器廠);血糖儀和血糖試紙長(zhǎng)沙三諾傳感生物技術(shù)有限公司．

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

按照文獻(xiàn)方法，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．精密吸取葡萄糖儲(chǔ)備液3，4，5，6，7 mL 分別置50 mL 量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻．分別吸取上述溶液0．5 mL(每0．5 mL含糖30～70μg)，置于10 mL具塞試管中，加入50 mL·L－1苯酚溶液 1 mL，迅速加入3 mL濃硫酸，迅速搖勻，于40℃水浴放置30 min后，自然冷卻15 min，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)、對(duì)照品質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程:Y=5．97X－0．093 8，相關(guān)系數(shù) r=0．999 9．

2．2 單因素實(shí)驗(yàn)

考察微波溫度、提取時(shí)間、微波功率3個(gè)因素對(duì)杏鮑菇多糖提取率的影響，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法計(jì)算多糖含量，選擇最佳單因素提取條件．每次準(zhǔn)確稱取杏鮑菇干粉2．0 g，分別對(duì)微波溫度(40，50，60，70 和80 ℃)，提取時(shí)間(4，6，8，10 和12 min)，微波功率(400，500，600，700 和 800 w)，三個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)．單因素實(shí)驗(yàn)的條件為微波溫度70℃、提取時(shí)間10 min、微波功率600 w．

2．3 正交實(shí)驗(yàn)

以微波溫度、提取時(shí)間、微波功率作為考察因素，多糖提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素與水平見表1，實(shí)驗(yàn)方法與單因素實(shí)驗(yàn)方法相似，每號(hào)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算提取率、K值、k值和R值，并進(jìn)行方差分析．

2．4 對(duì)腎上腺素所致高血糖小鼠的影響

取60只小鼠，按體重隨機(jī)分為空白組、模型組、格列本脲組、杏鮑菇多糖低、中、高劑量組．模型組及空白組給予蒸餾水，格列本脲組給予2．5%的格列本脲，杏鮑菇多糖低、中、高組分別給予3%、6%、12%的多糖溶液．以上各組均灌胃給藥，20 mg·kg－1，每天 1 次，連續(xù) 7 d．

末次給藥前禁食不禁水12 h，以血糖試紙測(cè)定各組動(dòng)物空腹血糖值作為藥前值，給藥30 min后，除空白組外其它各組均皮下注射0．1%腎上腺素0．25 mg·kg－1，以血糖試紙測(cè)定注射 0．1%腎上腺素后各組小鼠30 min、60 min、90 min的血糖值．

2．5 糖耐量實(shí)驗(yàn)

取60只昆明小鼠，雌雄各半，按體重隨機(jī)分6組，即空白組、模型組、格列本脲組、杏鮑菇多糖低、中、高劑量組．模型組及空白組給予蒸餾水，格列本脲組給予2．5%的格列本脲，杏鮑菇多糖低、中、高組分別給予3%、6%、12%的多糖溶液．以上各組均灌胃給藥，20 mL·kg－1，每天1次，連續(xù)10 d，末次給藥前禁食不禁水12 h，以血糖試紙測(cè)定各組動(dòng)物空腹血糖值作為藥前值，然后給藥．末次藥后60 min，除正常對(duì)照組外其他各組經(jīng)腹腔注射葡萄糖 2 g·kg－1，測(cè)定 30、60、90 min 的血糖值，觀察各組藥物作用．

3 結(jié)果與討論

3．1 單因素實(shí)驗(yàn)

微波溫度為70℃時(shí)，多糖的提取率最大，此后微波溫度升高，提取率減少;微波功率為700 W時(shí)，提取率最大，以后提取率下降，可能由于功率過(guò)大會(huì)引起糖結(jié)構(gòu)改變，多糖含量降低;杏鮑菇多糖提取率隨著提取時(shí)間的增大呈現(xiàn)先增大后減小，超聲時(shí)間10 min時(shí)多糖提取率最大，可能由提取時(shí)間小于10 min時(shí)，多糖類物質(zhì)還未充分溶出;提取時(shí)間大于10 min時(shí)，引起糖結(jié)構(gòu)變化甚至是碳環(huán)裂解或一些其他的成分溶出而使多糖類化合物提取率降低．

圖1 微波溫度對(duì)多糖含量的影響

圖2 微波功率對(duì)多糖含量的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響

3．2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇考察因素的3個(gè)實(shí)驗(yàn)水平，實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，采用直觀分析法比較K值可知，影響較為顯著的因素平分別為:A3、B3、C2．由極差 R值可知，A因素的R值最大，因此，A因素為影響杏鮑菇多糖提取率的主要因素，這3個(gè)因素對(duì)多糖提取率影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C，即微波時(shí)間＞微波功率＞提取時(shí)間．由直觀分析法可得杏鮑菇多糖的最佳的提取工藝為:A3B3C2，即微波溫度80℃、微波功率800 W、提取時(shí)間10 min．

表1 因素水平表

表3 方差分析表

方差分析結(jié)果見表3，由計(jì)算的F值與查表臨界值比較可判斷，A因素對(duì)杏鮑菇多糖提取率影響非常顯著P＜0．01，B和D因素對(duì)杏鮑菇多糖提取率影響不顯著P＞0．05，影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C，與直觀分析法所得結(jié)果基本一致．

因B因素影響不顯著，所以從降低生產(chǎn)成本角度考慮應(yīng)選B2水平，即700 W．綜上，最佳工藝條件為A3B2C2，即微波溫度80℃、微波功率700 W、提取時(shí)間10 min．為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，選取微波溫度80℃、微波功率700 W、提取時(shí)間10 min，進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算提取液中多糖的含量，3次平行實(shí)驗(yàn)得到實(shí)際平均總提取率為12．83%，RSD%為 0．19．

3．3 對(duì)腎上腺素所致高血糖小鼠的影響

如表4所示．與空白組比較，模型組30 min，60 min，90 min血糖值均有所升高，P ＜0．05，說(shuō)明高血糖模型造模成功;與模型組比較，杏鮑菇多糖中劑量組90 min，高劑量組60 min、90 min血糖值均有所降低，P ＜0．05．

表4 杏鮑菇多糖對(duì)腎上腺素所致高血糖的影響(mmol·L-1)(±S，n=10)

表4 杏鮑菇多糖對(duì)腎上腺素所致高血糖的影響(mmol·L-1)(±S，n=10)

＊＊P ＜0．01 vs Normal;#P ＜0．05 vs Model

5．19 ±0．22 Model 5．25 ±1．03 16．86 ±3．09＊＊ 14．03 ±3．93＊＊ 12．08 ±2．21＊＊低劑量組 5．21 ±0．55 17．58 ±2．15 14．60 ±3．29 12．26 ±1．21中劑量組 5．34 ±0．95 17．05 ±3．01 13．89 ±3．87 10．91 ±1．76#高劑量組 5．22 ±0．99 16．93 ±1．96 12．84 ±2．07# 10．69 ±2．69#Glibenclamide 5．19 ±0．67 16．99 ±1．97 9．97 ±1．78# 9．74 ±2．10 90 min Normal 5．21 ±0．23 5．26 ±0．11 5．24 ±0．45 Group 藥前值 30 min 60 min#

3．4 糖耐量實(shí)驗(yàn)

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠注射葡萄糖后30～120 min血糖均明顯升高，有顯著性差異(P＜0．01)．與模型組比較，格列本脲組注射葡萄糖后60、90 min血糖值明顯下降(P＜0．05或P＜0．01);杏鮑菇多糖低劑量組注射葡萄糖后120 min，中、高劑量組注射葡萄糖后 60 min、120 min血糖值均明顯下降(P＜0．05或 P＜0．01)，提示杏鮑菇多糖可明顯對(duì)抗葡萄糖所致的高血糖，見表5．

表5 杏鮑菇多糖對(duì)葡萄糖所致高血糖的影響±s，n=10)

表5 杏鮑菇多糖對(duì)葡萄糖所致高血糖的影響±s，n=10)

#P ＜0．05 vs Normal;*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01 vs Model

5．63 ±0．91 Model 5．65 ±1．16 14．22 ±0．99# 11．56 ±2．76# 10．71 ±1．75#低劑量組 5．79 ±1．12 12．81 ±1．16 10．15 ±2．11 6．32 ±1．58*中劑量組 5．78 ±1．09 11．92 ±1．67 8．24 ±1．33* 5．56 ±1．12＊＊高劑量組 5．65 ±0．98 11．67 ±1．70 8．18 ±1．01* 5．27 ±0．92＊＊Glibenclamide 5．71 ±1．19 11．48 ±2．01* 8．02 ±0．95* 5．01 ±1．72 120 min Normal 5．76 ±0．69 5．69 ±0．44 5．64 ±0．32 Group FBG/(mmol·L－1)0 min 30 min 60 min＊＊

4 結(jié) 論

采用F臨界值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析時(shí)，根據(jù)數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法［9-10］和張艷等［11］文獻(xiàn)報(bào)道，誤差自由度=實(shí)驗(yàn)號(hào)數(shù)×(每號(hào)實(shí)驗(yàn)次數(shù)-1)，本正交設(shè)計(jì)共9號(hào)實(shí)驗(yàn)，每號(hào)實(shí)驗(yàn)做3次，因此，誤差自由度=9×(3－1)=18，每一因素的自由度=水平數(shù)－1=3－1=2．查F分布臨界值表，F(xiàn)0．05(2，18)=3．55，F(xiàn)0．01(2，18)=6．01，F(xiàn)A ＞ F0．01(2，18)=6．01，P ＜ 0．01，F(xiàn)B 和 FC ＜ F0．05(2，18)=3．55，P ＞0．05．A 因素對(duì)杏鮑菇多糖提取率影響非常顯著，P＜0．01，B和C因素對(duì)杏鮑菇多糖提取率影響不顯著P＞0．05，與直觀分析法得到的影響順序基本一致．

血糖升高是糖尿病最基本臨床表現(xiàn)之一，糖尿病患者長(zhǎng)期高血糖環(huán)境是糖尿病并發(fā)癥形成的關(guān)鍵因素．腎上腺素是強(qiáng)有力的升高血糖的激素，給動(dòng)物注射0．1%腎上腺素后血糖水平迅速升高，可持續(xù)數(shù)幾小時(shí)．腎上腺素與肝臟和肌肉的細(xì)胞膜的β受體結(jié)合，通過(guò)G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶、增高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，抑制糖原合酶，從而加速糖原分解、抑制糖原合成［12-13］．本文研究杏鮑菇對(duì)腎上腺素所致高血糖的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示杏鮑菇多糖對(duì)0．1%腎上腺素所致高血糖有明顯的對(duì)抗作用，于藥后60 min開始起效持續(xù)到90 min．

葡萄糖作為最常用的刺激物在了解胰島β細(xì)胞功能、平菇機(jī)體調(diào)節(jié)血糖能力中廣泛應(yīng)用．葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)可反應(yīng)β細(xì)胞能否及時(shí)并且最大量釋放胰島素來(lái)緩沖外來(lái)葡萄糖負(fù)荷的能力［14］，因此可用l來(lái)評(píng)價(jià)β細(xì)胞釋放胰島素的能力．本文糖耐量實(shí)驗(yàn)表明杏鮑菇多糖對(duì)葡萄糖所致高血糖有明顯的對(duì)抗作用，于藥后60 min開始起效持續(xù)到120 min．

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