查道仁

(安徽省安慶市立醫(yī)院，安徽安慶 246003)

二十五味阿魏膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編中成藥地標(biāo)升國(guó)標(biāo)·經(jīng)絡(luò)肢體腦系分冊(cè)》(WS-10430(ZD-0430)-2002)，由阿魏等二十五味中藥組成［1］，具有祛風(fēng)鎮(zhèn)靜作用。由于4種鎮(zhèn)靜類化學(xué)藥物(卡托普利、氯氮、鹽酸異丙嗪、硝苯地平)的原料價(jià)廉易得，完全可能被不法分子用來添加到二十五味阿魏膠囊等同類中成藥中，有必要建立高效液相色譜測(cè)定方法［2］，檢測(cè)樣品中可能違法添加的4種鎮(zhèn)靜類化學(xué)藥物的含量。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀:Shimadzu LC-20A全自動(dòng)高效液相色譜儀;電子天平:METTLER AE240;卡托普利(KT)、氯氮 (LD)、鹽酸異丙嗪(YB)和硝苯地平(XB)對(duì)照品:中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批 號(hào) 分 別 為 100318-200602、171248-200301、100422-200501、100338-200502;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純;水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Inertsil ODS-SP(Shimadzu C18250 mm×4.6 mm);流動(dòng)相:乙腈—稀磷酸(每100 mL水中含0.2 mL磷酸)，按表1進(jìn)行梯度洗脫;柱溫:室溫;檢測(cè)波長(zhǎng):KT檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，LD、YB和XB檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。流速:1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量:10 μL。

2.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液的制備:避光操作。精密稱定KT、LD、YB和XB對(duì)照品，分別加甲醇制成濃度為20 mg·L-1的溶液，即得。其色譜圖見圖1。

供試品溶液的制備:避光操作。取本品內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱定0.5 g，置錐形瓶中，精密加入氯仿20.0 mL，密塞，稱定重量，超聲處理10 min，放冷后加氯仿補(bǔ)足減失重量，搖勻，離心。精密吸取上清液10.0 mL置蒸發(fā)皿中，揮干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，定容?5 mL容量瓶中，0.45 μm濾膜濾過，即得。其色譜圖見圖2。

加入4種對(duì)照品的供試品溶液的制備:取供試品，在定容前加入一定體積的4種對(duì)照品貯備液，其余方法同供試品溶液的制備，制成KT(4 mg·L-1)、LD(15 mg·L-1)、YB(5 mg·L-1)、XB(25 mg·L-1)后搖勻，即得。其色譜圖見圖3。

表1 梯度洗脫流動(dòng)相

圖1 4種混合對(duì)照品

圖2 二十五味阿魏膠囊供試品

圖3 加4種混合對(duì)照品的供試品

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取4種混合對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀中，結(jié)果4種對(duì)照品理論板數(shù)均大于4 000;分離度為3.3(應(yīng)≥1.5)，拖尾因子為0.995(應(yīng)為0.95～1.05)，重復(fù)性試驗(yàn)RSD均小于2.0%，均符合藥典規(guī)定。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密稱取KT、LD、YB和 XB 對(duì)照品 10.12、11.16、9.93、9.81 mg，加甲醇溶解定容至10 mL，制成每1 mL含 KT 1.012 mg、LD 1.116 mg、YB 0.993 mg、XB 0.981 mg 的溶液，作為對(duì)照品貯備液。精密吸取各貯備液，加甲醇制成系列濃度的混合對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各5 μL，注入液相色譜儀，依法測(cè)定。以進(jìn)樣量C(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)分別為:KT:A=1×106C-6 584.2;r2=1(n=6);LD:A=6×106C-34 368;r2=1(n=6);YB:A=4×106C-22 607;r2=0.999 9(n=6):XB:A=3×106C-11 176;r2=1(n=6)。結(jié)果 KT、LD、YB 和XB 分別在 0.010 12～2.47 μg，0.011 16 ～1.116 μg、0.009 93 ～0.993 μg和 0.009 81 ～0.981 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 避光操作。精密吸取一份混合對(duì)照品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積分值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果KT、LD、YB和XB峰面積的 RSD分別為 1.38%、0.50%、0.70%、2.11%，表明本法精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 避光操作。精密吸取一份混合對(duì)照品溶液，室溫下放置，分別于 0、1、2、4、10 h 按上述方法測(cè)定，測(cè)定其峰面積積分值A(chǔ)，結(jié)果KT、LD、YB和 XB峰面積的 RSD值分別為1.81%、0.68%、0.72%、2.26%，表明樣品溶液在10 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 避光操作。精密稱取0.5 g樣品(批號(hào)20100501)6份，分別精密加入每1 mL含卡托普利0.518 0 mg、氯氮 0.709 0 mg、鹽酸異丙嗪0.543 0 mg、硝苯地平1.071 mg的混合對(duì)照品溶液1.0 mL，置錐形瓶中，再精密加入氯仿19.0 mL，制成供試品溶液。精密吸取每1 mL含卡托普利0.518 0 mg、氯氮 0.709 0 mg、鹽酸異丙嗪0.543 0 mg、硝苯地平1.071 mg的混合對(duì)照品溶液1.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。分別吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果KT、LD、YB和XB的平均回收率分別為98.70%(RSD=2.86%，n=6)、97.19%(RSD=2.71%，n=6)、95.90%(RSD=2.48%，n=6)、99.41%(RSD=1.98%，n=6)，表明本法的準(zhǔn)確性較好。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 在上述色譜條件下，分別精密吸取各對(duì)照品溶液5 μL，注入液相色譜儀，各色譜峰用PDA檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示KT在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，紫外最大吸收不明顯，參照《中國(guó)藥典》2010年版二部選擇215 nm作為卡托普利的液相色譜檢測(cè)波長(zhǎng)［3-4］;LD的最大吸收波長(zhǎng)在245 nm和308 nm 處［5］，YB、XB 在245 nm 波長(zhǎng)處均有較大吸收［6-8］，故選擇245 nm 作為 LD、YB和 XB的液相色譜檢測(cè)波長(zhǎng)［9-10］。

3.2 提取溶劑的選擇 KT、LD、YB和XB在氯仿和甲醇中均易溶或溶解，但甲醇作為供試品提取溶劑時(shí)，樣品中其它成分干擾嚴(yán)重，色譜峰分離效果差，加樣回收率達(dá)不符合要求，而以氯仿為溶媒提取分離效果較好，故選擇氯仿作為供試品的提取溶劑。

3.3 色譜柱的選擇 避光操作。取回收率實(shí)驗(yàn)的同一份供試品溶液，分別在APOLLO C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和大連依利特 C18(250 mm × 4.6 mm，ODS2，5 μm)兩種色譜柱條件下，各進(jìn)樣2 次測(cè)定，結(jié)果顯示，在APOLLO C18色譜柱條件下，KT、YB分離度較差，LD、XB，兩峰峰形及分離度相對(duì)較好。大連依利特 C18色譜柱條件下僅KT、XB出峰。結(jié)果表明 APOLLO C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)色譜柱基本適用于本法，大連依利特 C18(250 mm×4.6 mm，ODS2，5 μm)色譜柱不適用于本法。

3.4 柱溫箱溫度影響試驗(yàn) 避光操作。取回收率實(shí)驗(yàn)的同一份對(duì)照品溶液，分別在柱溫箱溫度為25、30、35、40 ℃進(jìn)樣測(cè)定。樣品色譜圖上，KT、LD、YB和XB各峰峰形及分離度均較好。表明柱溫箱溫度對(duì)色譜分離的影響較小，本法適用于柱溫箱溫度低于40℃。

3.5 流動(dòng)相的選擇 取回收率實(shí)驗(yàn)的同一份供試品溶液，分別在流動(dòng)相為不同比例、不同梯度的甲醇—0.05%磷酸、甲醇—乙腈—0.2%磷酸、乙腈—0.2%磷酸進(jìn)樣測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明，選用乙腈—0.2%磷酸在前述梯度條件下，KT、LD、YB和XB各峰峰形及分離度均較好，二十五味阿魏膠囊樣品在相應(yīng)位置上無干擾。

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