陳 冬，孫 宏，陳明衛(wèi)，王佑民

(1.安徽省壽縣縣醫(yī)院內(nèi)科，安徽壽縣 232200;2.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽合肥 230022)

2型糖尿病是慢性炎癥性疾病［1］，其病理生理特征主要是胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，胰島素信號通路受損導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)轉(zhuǎn)位障礙，目前對GLUT4的研究成為糖尿病發(fā)病機制研究中熱點之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌作為一種非傳統(tǒng)意義上的內(nèi)分泌器官，在體內(nèi)也可表達并分泌一定量的脂聯(lián)素，體外研究發(fā)現(xiàn)分化的L6肌細胞也具有類似的生理效應(yīng)［2］。研究證實，作為脂肪因子之一的脂聯(lián)素，和胰島素抵抗之間有密切的關(guān)系［3］，但骨骼肌源性脂聯(lián)素的調(diào)控機制以及在骨骼肌IR發(fā)生發(fā)展中的地位和作用尚不清楚。本實驗通過建立棕櫚酸誘導(dǎo)的大鼠L6細胞IR模型，并應(yīng)用噻唑烷二酮類藥物(TZDs)吡格列酮干預(yù)，來探討骨骼肌源性脂聯(lián)素對骨骼肌IR模型GLUT4表達的影響，以及PPAR-γ激動劑吡格列酮其改善胰島素敏感性的機制是否涉及激活脂聯(lián)素。通過本研究，可增加對骨骼肌IR機制的認識，為臨床治療提供一定基礎(chǔ)依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗細胞與試劑 大鼠L6肌細胞;其他包括高糖DMEM培養(yǎng)基和無酚紅DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)PA及MTT;相關(guān)抗體包括兔抗鼠全長脂聯(lián)素抗體、GLUT4抗體;兔β-actin抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體和山羊抗鼠抗體;以及化學發(fā)光底物試劑盒。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 大鼠L6細胞復(fù)蘇后接種在培養(yǎng)瓶中，在細胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。后改用含2%胎牛血清的無酚紅DMEM培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)分化，至細胞生長出肌管，通過考馬斯藍染色，鑒定肌管形成后，認為大鼠L6細胞誘導(dǎo)分化成熟。

1.2.2 胰島素抵抗細胞模型的建立 (1)實驗分組:將細胞以每孔1×105個的密度接種于96孔培養(yǎng)板，誘導(dǎo)分化為成熟的骨骼肌細胞后，實驗分為①對照組(NC組)，即大鼠L6細胞組;②PA誘導(dǎo)組(IR 組)分別用不同濃度的 PA(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1)進行干預(yù)，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，分別收集培養(yǎng) 2、4、8、12、24、36 h 后的細胞上清液，建立胰島素抵抗組;③胰島素抵抗模型+吡格列酮組，在建立成功IR組基礎(chǔ)上，加用吡格列酮，建立IR+PIO組。(2)MTT法檢測棕櫚酸對L6細胞活性的影響:L6成肌細胞誘導(dǎo)分化為成熟骨骼肌細胞后，上述PA誘導(dǎo)組中分別加入10-7mol·L-1的胰島素。每孔加入MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h后，各孔加入DMSO 150 μL，搖床振蕩，酶標儀測定492 nm下各組細胞的吸光度，檢測棕櫚酸對各組細胞活性的影響。(3)葡萄糖消耗試驗:用葡萄糖氧化酶—過氧化物酶法測定上述各管上清液中所剩葡萄糖的濃度，同時建立標準管，在490 nm處測定各管吸光度。通過測定管與標準管吸光度的比值，確定上清液殘存的葡萄糖濃度，并最終確定胰島素抵抗模型的建立。(4)Western blot分別檢測NC組、IR組和IR+PIO組APN和GLUT4的蛋白表達:用APN和GLUT4灰度值與β-actin灰度值的比值作為APN和GLUT4的相對表達量。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。觀測資料主要為計量數(shù)據(jù)，以(±s)表示，均通過正態(tài)性檢驗。多組間多時點間綜合分析為兩因素重復(fù)測量方差分析;各組間比較采用獨立樣本t檢驗;以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度、不同時間的PA對L6細胞活性的影響 MTT結(jié)果顯示濃度為0.2～0.6 mmol·L-1的PA作用于L6細胞2～36 h后對細胞的活性無影響。而0.8～1.0 mmol·L-1的PA分別作用24、36 h時對細胞的活性有影響，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表 1。

表1 不同濃度、不同時間的PA對大鼠L6細胞活性的影響(±s)

表1 不同濃度、不同時間的PA對大鼠L6細胞活性的影響(±s)

注:與NC組比較，*P＜0.05。

作用時間/h組別 劑量/mmol·L-1 49±0.021 0.541±0.015 0.483±0.021 PA誘導(dǎo)組(IR組) 0.2 0.523±0.014 0.518±0.020 0.529±0.017 0.541±0.019 0.540±0.019 0.481±0.018 0.4 0.509±0.020 0.522±0.024 0.532±0.019 0.538±0.017 0.540±0.018 0.478±0.017 0.6 0.521±0.017 0.517±0.018 0.540±0.018 0.541±0.019 0.531±0.017 0.484±0.019 0.8 0.513±0.016 0.528±0.018 0.538±0.018 0.536±0.017 0.497±0.017*0.436±0.018*1.0 0.511±0.017 0.520±0.017 0.535±0.015 0.539±0.018 0.524±0.026*0.465±0.028 12 24 36 NC組 0.0 0.517±0.020 0.521±0.016 0.537±0.018 0.5 2 4 8*

2.2 不同濃度、不同時間的PA對L6細胞葡萄糖代謝的影響 (1)作用2 h后，各組上清液中剩余葡萄糖濃度與NC組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);(2)作用4 h后，1.0 mmol·L-1PA作用下的細胞上清液葡萄糖濃度明顯高于NC組(P＜0.05)，其余濃度的PA組和NC組相比較，無統(tǒng)計學差異(P ＞0.05);(3)作用 8、12 h 后，0.6、0.8、1.0 mmol·L-1PA作用下的細胞上清液葡萄糖濃度明顯高于 NC 組(P ＜0.05)，0.2、0.4 mmol·L-1濃度的PA組與NC組相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05);(4)作用 24 h 以后，0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1PA作用下的細胞上清液葡萄糖濃度較NC組顯著升高(P＜0.05)，而0.2 mmol·L-1濃度的PA組與NC組相比較，差異始終無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.3 三組脂聯(lián)素及GLT4的Western blot表達水平印跡圖 見圖1。兩兩比較顯示:(1)與NC組比較，IR組APN、GULT4蛋白表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見圖2);(3)與IR組比較，IR+PIO組APN、GULT4蛋白表達水平均增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見圖3)。

圖1 三組APN及GLUT4蛋白表達水平印跡圖

圖2 NC組和IR組APN和GLUT4蛋白水平表達比較

圖3 IR組和IR+PIO組APN和GLUT4蛋白水平表達比較

3 討論

為研究骨骼肌IR發(fā)生機制，建立相關(guān)的胰島素抵抗模型尤為重要。因為胰島素刺激下的骨骼肌細胞的葡萄糖代謝能力是判斷骨骼肌胰島素敏感性的主要指標，故本研究應(yīng)用葡萄糖氧化酶—過氧化物酶法(GOD-POD法)檢測在不同濃度、不同時間的棕櫚酸作用下的L6細胞培養(yǎng)液中殘存葡萄糖含量，來評價L6細胞在胰島素刺激下的葡萄糖攝取和利用能力，即胰島素敏感性，從而判斷是否存在IR，以及IR模型建立成功與否［4］。研究發(fā)現(xiàn)，通過對不同時間、不同濃度PA作用后的L6細胞上清液殘存葡萄糖濃度測定，顯示PA對胰島素刺激下的骨骼肌細胞的葡萄糖代謝能力有抑制作用。在本研究中，當較高濃度的PA作用于L6細胞達24 h后，MTT方法測定的細胞活性明顯降低，提示高濃度棕櫚酸長時間刺激可對L6細胞的活性產(chǎn)生抑制作用。由于上清液中葡萄糖濃度的增加，可間接反映胰島素刺激下的L6細胞的葡萄糖代謝能力的降低，即L6細胞胰島素敏感性的降低，由此可以認為本研究中PA誘導(dǎo)的大鼠L6細胞IR模型建立成功。實驗發(fā)現(xiàn)，這種模型的建立與PA的作用濃度密切相關(guān)，PA濃度為0.4 mmol·L-1至少24 h后才能建立，而當PA濃度提高至1.0 mmol·L-1時，4 h后即可建立，與國內(nèi)相關(guān)文獻報道基本一致［5］。

自1995年Scherer和Lodish首次發(fā)現(xiàn)了脂聯(lián)素的存在，目前相關(guān)研究證明，脂聯(lián)素除在脂肪組織大量表達外，在一些非脂肪組織細胞中也有表達。而對脂肪組織以外脂聯(lián)素的研究相對較少，其作用機制尚不明確。Krause等［6］證實在大鼠骨骼肌組織以及L6肌細胞中存在脂聯(lián)素的表達，表達的分布不僅在肌細胞肌膜中，而且在肌細胞的IIA以及IID型肌纖維中也存在。通過對脂聯(lián)素基因敲除大鼠的進一步研究，發(fā)現(xiàn)骨骼肌分泌的脂聯(lián)素在維持骨骼肌收縮功能以及表型等方面發(fā)揮重要作用，初步證明骨骼肌可以通過自分泌的方式分泌脂聯(lián)素，并在保持骨骼肌細胞功能、脂肪酸β氧化以及葡萄糖攝取等方面發(fā)揮重要的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，無論在NC組還是IR組，應(yīng)用Western blot方法，均發(fā)現(xiàn)L6肌細胞表達脂聯(lián)素，和國外報道相一致［6］。

與對照組相比，IR組中的L6肌細胞脂聯(lián)素表達水平明顯下降，表明L6肌細胞脂聯(lián)素表達與骨骼肌IR之間存在內(nèi)在聯(lián)系。有關(guān)IR狀態(tài)下骨骼肌源性脂聯(lián)素下調(diào)表達的原因，目前尚不清楚。Coll等［7］研究發(fā)現(xiàn)棕櫚酸誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了骨骼肌的胰島素抵抗。相關(guān)炎癥因子表達增加，抑制骨骼肌細胞內(nèi)過氧化物酶體增值物激活受體(PPAR)的表達。骨骼肌細胞中脂聯(lián)素的表達是依賴于PPAR的方式。其中PPAR-γ在葡萄糖代謝中起重要作用。PPAR-γ增加胰島素敏感性的機制，一個重要的方面就是通過脂聯(lián)素等信號通路來參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。Lopez等［8］研究表明TZD可直接作用于大鼠骨骼肌L6細胞內(nèi)PPAR-γ。同時，Hajri等［9］發(fā)現(xiàn)在3T3-L1和人體脂肪細胞的培養(yǎng)中，胰島素可明顯增加脂聯(lián)素的表達和分泌，而TNF-α和IL-6則可強烈抑制這種效應(yīng)。正是多因素的共同作用，導(dǎo)致在骨骼肌IR模型中，脂聯(lián)素的表達明顯減少。而在骨骼肌IR模型中，加入PPAR-γ激動劑吡格列酮后，脂聯(lián)素表達水平較前顯著增加，與NC組無顯著差異，表明骨骼肌源性脂聯(lián)素的表達是依賴于PPAR-γ的方式。TZD直接作用于大鼠骨骼肌L6細胞內(nèi)PPAR-γ，從而刺激脂聯(lián)素的分泌。

關(guān)于脂聯(lián)素增加GLUT4的分泌，目前普遍認為，在骨骼肌中，脂聯(lián)素首先與脂聯(lián)素受體1在細胞膜外結(jié)合后，刺激脂聯(lián)素受體結(jié)合蛋白1(APPL1)的結(jié)合，再激活下游信號傳導(dǎo)通路，最終完成增加骨骼肌細胞脂肪酸氧化、GLUT4的表達和膜轉(zhuǎn)位，改善骨骼肌IR等生物學效應(yīng)。GLUT4是主要的葡萄糖運載體，其所介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運是骨骼肌糖代謝的主要限速步驟。GLUT4的這種活性狀態(tài)的改變與骨骼肌IR密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)［10］脂聯(lián)素在骨骼肌與其受體結(jié)合后，可激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的活性，活化的AMPK可抑制S6激酶(S6K)，進而減弱對胰島素受體底物1(IRS-1)的負性調(diào)節(jié)作用，證明脂聯(lián)素信號通路可能與胰島素信號通路相互交叉，相互聯(lián)系。因此，脂聯(lián)素提高骨骼肌胰島素敏感性的生物學機制之一可能是通過活化AMPK途徑實現(xiàn)，并激活其下游p38MAPK信號通路，增加GLUT4的表達［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，和對照組比較，在骨骼肌IR模型組中，應(yīng)用Western blot方法測定的L6細胞源性脂聯(lián)素表達水平下降，同時L6細胞中GLUT4的表達下降。而在加入PPAR-γ激動劑吡格列酮后，脂聯(lián)素表達增加，GLUT4表達也同步增加。這種同向改變的趨勢，表明L6細胞源性脂聯(lián)素表達和其GLUT4表達是密切相關(guān)的，骨骼肌源性脂聯(lián)素增加骨骼肌中GLUT4活性，從而可能對骨骼肌IR狀態(tài)發(fā)揮改善作用。

總之，通過本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠L6細胞株通過培養(yǎng)并分化成熟后，經(jīng)過棕櫚酸的誘導(dǎo)，可以較容易建立大鼠L6細胞胰島素抵抗模型;大鼠L6細胞可以分泌和表達脂聯(lián)素，骨骼肌源性脂聯(lián)素上調(diào)L6細胞GLUT4的表達;吡格列酮作為 PPAR-γ激動劑，可增加大鼠L6細胞脂聯(lián)素的分泌，進而改善胰島素敏感性。

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