盧玉標(biāo) 游翠紅 王樹啟 李遠友

(汕頭大學(xué)海洋生物研究所, 廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室, 汕頭515063)

魚類是低等脊椎動物, 與高等脊椎動物相比,魚類對生存環(huán)境的依賴性較強, 但仍具有對環(huán)境脅迫產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的能力。在自然條件下, 魚類可以通過應(yīng)激反應(yīng)來適應(yīng)環(huán)境的變化。然而, 在養(yǎng)殖生產(chǎn)中, 魚體不能逃避或克服人為的應(yīng)激脅迫。此時,應(yīng)激反應(yīng)對魚體是有害的, 且應(yīng)激反應(yīng)越強, 傷害越大。因此, 正確認識魚類應(yīng)激并采取適當(dāng)措施減少應(yīng)激的危害, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

魚類應(yīng)激反應(yīng)從神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)開始, 主要表現(xiàn)在兩個系統(tǒng): 一個是交感神經(jīng)－嗜鉻組織系統(tǒng)(SC系統(tǒng)), 另一個是下丘腦－垂體－腎間組織軸(HPI軸), 分別釋放腎上腺素和皮質(zhì)醇到血液中[1]。腎上腺素主要通過促進糖原分解在短期內(nèi)提供能量[2],皮質(zhì)醇主要通過促進葡萄糖異生以及脂肪和蛋白質(zhì)的分解代謝在長期內(nèi)提供能量[3,4]。細胞應(yīng)激反應(yīng)的一個共同特征是在應(yīng)激時產(chǎn)生熱休克蛋白(HSPs)。熱休克蛋白70 (HSP70)是機體在應(yīng)激情況下細胞內(nèi)迅速合成的一種蛋白質(zhì), 具有高度保守性, 對應(yīng)激可產(chǎn)生保護、耐受作用, 且具有交叉耐受性[5]; 可以清除應(yīng)激所造成細胞內(nèi)的異?；蜃冃缘鞍踪|(zhì), 具有活化其他細胞基因的作用[6]; 能夠抑制由于 ATP損耗引起的細胞凋亡[7]。魚類HSP70 在各種應(yīng)激條件下的表達情況一直是魚類熱休克蛋白發(fā)現(xiàn)以來的研究熱點。

黃斑藍子魚(Siganus canaliculatus)為暖水近海小型魚類, 常棲息于巖礁和珊瑚叢中, 具集群游動和覓食特性, 有一定的維護領(lǐng)地和排他性攻擊行為,各鰭棘有毒腺[8]。本課題組發(fā)現(xiàn)該魚具有合成高度不飽和脂肪酸(HUFA)的能力[9], 這是首次報道具有HUFA合成能力的海水魚類。該魚富含HUFA, 肉質(zhì)細嫩, 味道鮮美, 骨刺較少, 營養(yǎng)價值高[10]; 種苗來源較廣, 飼養(yǎng)周期較短, 已成為海水養(yǎng)殖專家積極推薦的規(guī)?；B(yǎng)殖新品種[11]。但該魚受到刺激時容易受到驚嚇, 產(chǎn)生較強烈的應(yīng)激反應(yīng), 如鰭條張開伸直, 驚恐亂竄, 體色急劇變?yōu)樯詈谏? 甚至沿著水面向上跳躍[8]; 在拉網(wǎng)、捕撈、分魚和藥浴等操作過程中容易受傷甚至死亡, 帶來較嚴重的經(jīng)濟損失。因此, 研究藍子魚應(yīng)激反應(yīng)特點和機制, 探討弱化其應(yīng)激反應(yīng)的方法將具有重要的理論和現(xiàn)實意義,也是開展規(guī)?；B(yǎng)殖與繁殖的關(guān)鍵之一[12]。然而,目前未見這方面的研究報道。

牛磺酸, 化學(xué)名為 2-氨基乙磺酸, 可溶于水, 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定, 是一種非蛋白條件性必需氨基酸[13]。它具有較廣泛的生物學(xué)功能, 如參與神經(jīng)和視覺發(fā)育,滲透壓調(diào)控, 膽汁酸合成和脂肪代謝; 具有保護細胞膜, 解毒抗氧化, 調(diào)節(jié)鈣離子通道, 影響激素釋放等作用; 作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì), 能調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的活動, 發(fā)揮安定鎮(zhèn)靜、抗驚厥的作用, 可以降低機體對應(yīng)激的反應(yīng)性, 起預(yù)防應(yīng)激的作用[14,15]。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中, 為了緩解應(yīng)激所造成的負面影響, 通常在飼料或水體中添加一定的抗應(yīng)激物質(zhì)。目前, 關(guān)于?；撬嶙鳛轸~類抗應(yīng)激物的研究報道很少。結(jié)合藍子魚應(yīng)激敏感性高的特點, 本試驗探討?；撬釋S斑藍子魚的抗應(yīng)激作用。

由于淺水應(yīng)激是拉網(wǎng)、捕撈、分魚和藥浴等操作過程中常面臨的應(yīng)激類型, 且容易精確控制和重復(fù), 也不受魚體大小和實驗環(huán)境的影響[16,17], 所以本研究擬選取急性淺水應(yīng)激作為實驗應(yīng)激處理方式。主要通過測定血清腎上腺素、皮質(zhì)醇、膽固醇和葡萄糖等生理生化指標(biāo)以及腦 HSP70 mRNA的變化情況, 研究黃斑藍子魚的急性應(yīng)激反應(yīng)特點和評估?；撬岬目箲?yīng)激效果。

1 材料與方法

1.1 實驗魚與馴養(yǎng)管理

實驗所用黃斑藍子魚捕自汕頭大學(xué)海洋生物實驗室南澳臨海實驗站附近海域, 選取規(guī)格基本一致(30 g左右)的魚于室內(nèi)圓柱形養(yǎng)殖缸(70 cm×60 cm,200 L)內(nèi)馴養(yǎng), 共12個缸, 每缸20尾, 采用微流水養(yǎng)殖。養(yǎng)殖用水為沙濾后的天然海水, 鹽度(30±2) ‰, 水溫為(28±1)℃, pH 7.5 左右; 適量連續(xù)充氣,水體溶氧≥5 mg/L; 日光燈調(diào)整光照時間每日12h。每天用本實驗室配制的人工配合顆粒飼料飽食投喂2次(8:30, 16:30)。每天清晨用虹吸法去除水族缸底部的糞便。盡量減少人為干擾, 保持安靜, 防止額外應(yīng)激。

1.2 實驗設(shè)計

實驗魚馴養(yǎng) 15d后用于應(yīng)激實驗。魚禁食 24h后, 將其中 1個缸的水緩慢放掉大部分(不驚擾魚)后, 往缸里加入麻醉劑 2-苯氧基乙醇(0.5 mL/L)使魚被迅速麻醉, 然后隨機取 9尾魚的樣品, 作為應(yīng)激前取樣點。另外 5個缸用于淺水應(yīng)激處理, 即將缸中水緩慢放掉至魚體露出背部, 魚產(chǎn)生強烈的應(yīng)激反應(yīng)(鰭條張開伸直、驚恐亂竄); 4min后向其中一個缸內(nèi)快速加入 2-苯氧基乙醇(0.5 mL/L)將魚麻醉,作為應(yīng)激后0min取樣點; 向其余4個缸內(nèi)重新注入適量海水, 分別于 20、40、60、80min后從各缸隨機取9尾魚的樣品, 作為應(yīng)激后20、40、60、80min取樣點。它們也作為?；撬峤莸膶φ战M。另外 6個缸在應(yīng)激處理前用0.02‰的?；撬峤?d, 進行與上述相同的應(yīng)激處理與取樣。

1.3 樣品采集和處理

在每個取樣點, 用 1 mL一次性醫(yī)用注射器于尾靜脈快速取血, 每條魚取0.5 mL左右。血樣于4℃靜置4h以后, 在4℃、4000 r/ min下離心10min, 收集血清保存于–20℃下用于生化指標(biāo)測定。另外將魚解剖, 取鰓和腦入液氮速凍后, 保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血清生化指標(biāo)測定

血清皮質(zhì)醇和腎上腺素濃度使用美國 RB公司的ELISA試劑盒測定, 葡萄糖和膽固醇濃度使用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。

1.5 腦HSP70 mRNA 測定

利用Trizol試劑(Invitrogen, USA)從藍子魚腦樣品中提取總RNA, 然后使用PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)(Takara Code: DRR037)進行反轉(zhuǎn)錄獲得單鏈 cDNA。根據(jù)黃斑藍子魚 HSP70 mRNA 部分序列(GenBank Accession No.: EU 107279.1), 利用primer premier5.0軟件設(shè)計HSP70特異性引物 F1(5'-TGGATAAAGGCAAACGAGGA GA-3')和R1(5'-GCTCTCTTGTTTTGGCTGATGTC-3')。管家基因 β-actin 的引物為 F2(5'-ATCGGC AATGAGAGGTTCC-3')和 R2(5'-GACAGCACAG TGTTGGCGT-3')[18]。使用 SYBR Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(Takara Code: DRR420A)和ABI 730 system real-time PCR儀進行real-time PCR擴增反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系: SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10 μL;正向引物(10 μmol/L) 0.4 μL; 反向引物(10 μmol/L) 0.4 μL; ROX Reference Dye (50×)0.4 μL; 模板 2 μL; 雙蒸水 6.8 μL; 總體積為 20 μL。PCR 擴增條件為: 預(yù)變性, 95℃ 30s; PCR反應(yīng),95℃ 5s、60℃ 31s, 40個循環(huán); 溶解條件為: 95℃15s、60℃ 1min、95℃ 15s。隨機取樣品 cDNA, 通過梯度稀釋法, 制作 HSP70和 β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線,由兩標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的斜率求得HSP70 和β-actin 的擴增效率基本相同在 0.9—1, 符合 2–ΔΔCt方法計算的前提條件。以黃斑藍子魚β-actin為內(nèi)參, 以對照組應(yīng)激前HSP70 mRNA為基準(zhǔn), 對得到的各樣品Ct值進行均一化處理, 應(yīng)用 2–ΔΔCt計算方法[19]確定各樣品HSP70 mRNA相對水平。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用 Origin 7.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)和Tukey多重比較法分析, 當(dāng) P < 0.05 時認為差異顯著。所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean± SEM, n=9)表示。

2 結(jié)果

2.1 在急性淺水應(yīng)激后黃斑藍子魚血清腎上腺素和葡萄糖濃度的變化情況

在急性淺水應(yīng)激后, 黃斑藍子魚的血清腎上腺素和葡萄糖濃度的變化情況見圖1。在4min淺水應(yīng)激后, 血清腎上腺素濃度迅速升高, 在0min時從應(yīng)激前的(2.00±0.22) ng/mL 達到應(yīng)激后的(15.12±1.04) ng/mL(P<0.05), 之后逐漸恢復(fù)到應(yīng)激前水平; 血清葡萄糖濃度在應(yīng)激后逐漸升高, 20min時達到最大值(7.10±0.38) mmol/L, 是應(yīng)激前(2.15±0.02) mmol/L的約3.5倍(P<0.05), 60min后恢復(fù)到應(yīng)激前水平。這說明, 血清腎上腺素和葡萄糖濃度可以作為黃斑藍子魚急性應(yīng)激反應(yīng)的指標(biāo)。

2.2 在急性淺水應(yīng)激后黃斑藍子魚血清膽固醇和皮質(zhì)醇水平的變化情況

在急性淺水應(yīng)激后, 黃斑藍子魚的血清膽固醇和皮質(zhì)醇水平的變化情況見表1。在4min淺水應(yīng)激后, 血清皮質(zhì)醇和膽固醇濃度沒有發(fā)生顯著變化(P>0.05)。這說明血清皮質(zhì)醇和膽固醇濃度不適合作為黃斑藍子魚急性應(yīng)激反應(yīng)的指標(biāo)。

2.3 在急性淺水應(yīng)激后黃斑藍子魚腦 HSP70 mRNA水平的變化情況

在急性淺水應(yīng)激后, 黃斑藍子魚腦 HSP70 mRNA的變化情況見圖2。在4min淺水應(yīng)激后, 腦HSP70 mRNA的表達水平逐漸增加, 在應(yīng)激后60min達到最大值, 約為應(yīng)激前的11.54倍(P<0.05),然后下降到接近應(yīng)急前水平。這說明HSP70 mRNA的表達水平也可以作為黃斑藍子魚急性應(yīng)激反應(yīng)的有效指標(biāo)。

圖1 急性淺水應(yīng)激后黃斑藍子魚血清腎上腺素(A)和葡萄糖(B)的變化情況Fig. 1 The changes of serum adrenaline (A) and glucose (B) levels in Siganus canaliculatus post the acute stress

表1 急性淺水應(yīng)激后黃斑藍子魚血清皮質(zhì)醇和膽固醇的變化情況Tab. 1 The changes of cortisol and cholesterol in serum of Siganus canaliculatus post the acute stress

圖2 急性淺水應(yīng)激后黃斑藍子魚腦HSP70 mRNA的變化情況Fig. 2 Changes of HSP70 mRNA level in the brain of Siganus canaliculatus post the acute stress

2.4 ?；撬峤輰S斑藍子魚急性應(yīng)激反應(yīng)的影響

牛磺酸浸泡組與對照組的結(jié)果比較見圖 3。根據(jù)上述結(jié)果, 在應(yīng)激后0、20、60min時, 血清腎上腺素、葡萄糖和腦HSP70 mRNA的水平分別達到最大值且顯著高于其他時間點。為此, 本部分分別比較此 3個時間點的血清腎上腺素、葡萄糖和腦HSP70 mRNA水平。結(jié)果顯示, ?；撬峤輰?yīng)激前藍子魚的血清腎上腺素、葡萄糖濃度和腦HSP70 mRNA水平?jīng)]有影響, 但顯著降低了急性應(yīng)激后的上述3個生理生化指標(biāo)的水平(P<0.05)。這說明?；撬峤輰S斑藍子魚具有明顯的抗急性應(yīng)激效果。

3 討論

一般認為, 魚類在應(yīng)激因子刺激后, 第一階段出現(xiàn)交感－嗜鉻組織系統(tǒng)反應(yīng), 表現(xiàn)為血液中腎上腺素濃度升高; 第二階段(應(yīng)激刺激幾十分鐘后)出現(xiàn)下丘腦－垂體－腎間組織軸反應(yīng), 表現(xiàn)為血液中皮質(zhì)醇濃度的升高。在本研究中, 黃斑藍子魚受到短暫淺水應(yīng)激后, 血清腎上腺素濃度立即顯著升高,而血清皮質(zhì)醇濃度沒有顯著變化, 與之相符。腎上腺素可以作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng), 提高其興奮性, 使機體處于警覺狀態(tài)[20]。這與黃斑藍子魚警覺性高、容易受驚的特性相符。血液腎上腺素的變化常發(fā)生在捕撈活動中漁具對魚體的刺激及魚類在逃逸過程中的生理應(yīng)激反應(yīng)中。例如, 裸蓋魚(Anoplopoma fimbria)在被漁具鉤住或者在網(wǎng)中拖拽后, 其血液腎上腺素濃度產(chǎn)生明顯變化[21]; 大菱鲆在暴露于空氣和圍網(wǎng)封閉擁擠兩種脅迫下, 魚體都表現(xiàn)出腎上腺素含量升高[22]; 在捕獲脅迫中從漁具中逃逸的真鯛的血漿腎上腺素含量顯著高于滯留在網(wǎng)具中的魚[23]; 野生綠背菱鰈(Rhombosolea tapirina)在捕獲、裝載及運輸后, 血液腎上腺素濃度顯著升高[24]。此外,其他一些環(huán)境因素也會影響魚體的腎上腺素水平。例如, 把大菱鲆(Scophthalmus maximus L.) 和真鯛(Pagrus major)養(yǎng)殖在一定濃度的氨氮水體中, 其血液腎上腺素含量可以反映出魚體所受脅迫的程度[25];魚體血液腎上腺素的含量也會在體外寄生蟲等生物因子的作用下發(fā)生變化[26]。

圖3 ?；撬峤輰毙詼\水應(yīng)激后黃斑藍子魚血清腎上腺素(A)、葡萄糖濃度(B)和腦HSP70 mRNA(C)水平變化的影響Fig. 3 Effects of taurine immersion on serum adrenaline(A),glucose(B) and brain HSP70 mRNA(C) levels of Siganus canaliculatus post the acute stress

血液皮質(zhì)醇水平的升高常被看作是魚類應(yīng)激的靈敏信號[27]。在本研究中, 黃斑藍子魚血清皮質(zhì)醇濃度在應(yīng)激后沒有顯著變化, 這可能是應(yīng)激時間(4min)不夠長的原因。Haddy[28]也報道捕撈行為等并沒有引起布氏棘鯛(Acanthopagrus butcheri)皮質(zhì)醇濃度的變化。然而, 振蕩可以使鯽(Carassius Auratus)的皮質(zhì)醇濃度在幾分鐘內(nèi)顯著升高[29]。Fevolden, et al.[30]認為, 應(yīng)激后血液皮質(zhì)醇濃度存在差異可能是由魚自身相關(guān)基因決定的。作為皮質(zhì)醇合成的前體物質(zhì), 膽固醇在本研究中也沒有發(fā)生顯著性變化。與此相似, 斑點叉尾(Ictalurus punctatus)受到急性應(yīng)激后, 其血中膽固醇水平也沒有顯著變化[31]。

血糖是機體內(nèi)主要的供能物質(zhì), 常態(tài)下其含量比較恒定; 隨著環(huán)境和機體活動的變化, 血糖含量也會發(fā)生變化。應(yīng)激反應(yīng)是一種耗能過程, 會導(dǎo)致血糖水平的變化, 因此血糖水平常被作為可靠的生理應(yīng)激指標(biāo)之一[32]。在本研究中, 隨著血清腎上腺素濃度的升高, 血清葡萄糖濃度在應(yīng)激后20min顯著升高到最大值, 之后又隨著腎上腺素水平的下降逐漸降低到應(yīng)激前水平。由于皮質(zhì)醇濃度沒有發(fā)生變化, 說明黃斑藍子魚急性應(yīng)激后血清葡萄糖濃度的升高可能主要是通過腎上腺素促進糖原分解實現(xiàn)的。相似的結(jié)果在兩種珊瑚鱒(Plectropomus leopardus 和 P.maculatus)的生理應(yīng)激反應(yīng)中也有報道[33]。

養(yǎng)殖動物應(yīng)激時會發(fā)生一系列的生理變化, 除神經(jīng)內(nèi)分泌激素、血糖濃度發(fā)生變化外, 與細胞反應(yīng)相關(guān)的熱休克蛋白也發(fā)生變化。在一定的脅迫范圍內(nèi), 熱休克蛋白常被誘導(dǎo), 從而形成保護性機制,抵消脅迫對養(yǎng)殖動物的影響[34]。黃斑藍子魚受到急性淺水應(yīng)激后, HSP70 mRNA表達量顯著升高, 說明 HSP70對魚體應(yīng)激時可能具有保護作用。然而,低溫、擁擠和捕捉等脅迫因子并沒有顯著影響大西洋鮭體內(nèi)的熱休克蛋白水平[35]; 注射操作也不會影響劍尾魚HSP70變化[36]。黃斑藍子魚受到4min淺水應(yīng)激后HSP70 mRNA水平顯著升高, 正好印證了藍子魚應(yīng)激反應(yīng)強的特點。

在養(yǎng)殖生產(chǎn)中, 藥浴、分魚、運輸?shù)炔僮鬟^程常引起魚類較強烈的應(yīng)激反應(yīng), 人們通常在操作前通過加入麻醉鎮(zhèn)靜劑來降低應(yīng)激反應(yīng)給魚體帶來的危害[37]?？紤]到麻醉劑的安全性及劑量控制等問題[38],本研究選用具有安定鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用等多種生物學(xué)功能的?；撬嶙鳛榻档退{子魚急性應(yīng)激反應(yīng)的物質(zhì)。結(jié)果表明, ?；撬峤菘娠@著降低黃斑藍子魚急性應(yīng)激后的血清腎上腺素、葡萄糖濃度和腦HSP70 mRNA水平, 說明?；撬岬目箲?yīng)激作用明顯。這與Kumar, et al.[39]報道?；撬峤菘梢越档秃T(Clarias batrachus)由鎘誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激相似?？箲?yīng)激劑也可通過添加到飼料中的方式進行應(yīng)用。例如, 用含 0.1%葡聚糖的飼料投喂虹鱒(Oncorhynchus mykiss)可以降低運輸應(yīng)激帶來的危害[40]; 棉子糖的添加能夠提高花鱸(Lateolabrax japonicus)抗空氣暴露應(yīng)激能力[41]。?；撬崽砑拥斤暳现泻蟮目箲?yīng)激效果有待研究。牛磺酸可通過化學(xué)合成的方法大批量生產(chǎn), 價格約2.5—3萬元/噸, 且預(yù)期未來不會上漲。目前, ?；撬嵋炎鳛檎T食劑和促生長劑普遍應(yīng)用于魚類養(yǎng)殖中[42], 考慮到其安全性好且劑量容易控制, 相信其作為抗應(yīng)激添加劑具有良好的應(yīng)用前景。

4 總結(jié)

應(yīng)對急性應(yīng)激, 黃斑藍子魚的血清腎上腺素濃度迅速上升, 促進糖原分解, 使血糖濃度升高來滿足應(yīng)激對能量的需求; 同時, 通過誘導(dǎo)細胞熱休克蛋白的表達增強對機體的保護。所以, 血清腎上腺素和葡萄糖濃度以及細胞 HSP70 mRNA水平可以作為反映黃斑藍子魚應(yīng)激狀況的有效指標(biāo)。?；撬峋哂幸欢ǖ目箲?yīng)激作用。