賈云璐 陳 偉 趙 爽 周起超 宋立榮

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

淡水水體富營養(yǎng)化的加劇導(dǎo)致大量產(chǎn)毒藍(lán)藻生長形成水華, 并威脅飲用水安全。水體中存在的藍(lán)藻毒素種類很多, 以肝臟毒性著稱的微囊藻毒素(MCs)是最為常見的毒素種類, 因危害性大, 受到的關(guān)注也最多[1—5]。

MCs可溶于水[6—8], 其中最主要一種異構(gòu)體MC-LR[9]在水中的溶解度大于1 g/L。在水中, 藍(lán)藻水華釋放出的 MCs主要以溶解態(tài)的形式分布于水柱中, 少量被吸附到底泥或是懸浮物上形成顆粒態(tài)藻毒素[6]。測(cè)定水中溶解態(tài)藻毒素, 水樣一般要經(jīng)過膜過濾去除藻細(xì)胞及其他形式 MCs[4,7,10], 但是樣品制備過程尚無標(biāo)準(zhǔn)操作程序可循。為了更準(zhǔn)確地測(cè)定溶解態(tài)MCs濃度, 評(píng)估水中MCs的分布和潛在風(fēng)險(xiǎn), 本文比較了幾種常見膜過濾樣品制備方法和常規(guī)離心法對(duì)溶解態(tài)藻毒素測(cè)定結(jié)果的影響。本研究將為進(jìn)一步制定水體溶解態(tài)微囊藻毒素的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)方法提供一些方法學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

Millipore超純水儀, 高速低溫離心機(jī)(德國eppendorf公司)。HPLC采用島津LC-10A 高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司), 配備有 UV檢測(cè)器和LC-10A數(shù)據(jù)系統(tǒng)。用于 HPLC分析的 MC-LR,MC-YR和MC-RR標(biāo)準(zhǔn)品購買自WAKO公司(日本),實(shí)驗(yàn)用純毒素純化參考陳偉等建立的方法[11], 并通過國內(nèi)外三個(gè)實(shí)驗(yàn)室比對(duì), 其純度大于 99%, 可以作為標(biāo)準(zhǔn)品使用。實(shí)驗(yàn)中使用濾器和濾膜的規(guī)格和生產(chǎn)廠家等信息如表1所示。

模擬試驗(yàn)的原水水樣采集于武漢市東湖, 經(jīng)ELISA方法檢測(cè)無藻毒素檢出; 野外水華水樣采集(2011年9月)于安徽省巢湖(Ch-W: N 31°41'47.4", E 117°21'44.8"; Ch-E: N 31°35'32.6", E 117°48'36.9")和江蘇省太湖(Th-W: N 31°26'58.7", E 120°1'43.2";Th-N: N 31°24'39.2", E 120°11'14.3")。

1.2 HPLC (High Performance Liquid Chromatogram)法分析高濃度的微囊藻毒素樣品

分析時(shí)所用色譜柱為島津 ODS柱(4.6 mm×150 mm), 檢測(cè)波長為238 nm, 流動(dòng)相為60%甲醇,40%磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L K2HPO4, pH=3), 流速為1.0 mL/min, 進(jìn)樣量為10 μL。

1.3 IC ELISA(anti-immune complex ELISA)酶聯(lián)免疫法分析低濃度的微囊藻毒素樣品

ELISA試劑盒及測(cè)定方法, 參照國標(biāo)方法GB/T20466-2006。IISMCLR單克隆抗體包被96孔酶標(biāo)板,4℃過夜, 0.5%明膠封阻, 37℃反應(yīng)2h, 用PBS-T洗滌3次, 加入毒素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品100 mL, 37℃放置1h, 每孔繼續(xù)加入 100 L生物毒化的單克隆抗體,室溫放置 2h, PBS-T洗滌 3次, 以 1︰1000稀釋HRP/Streptavidin (辣根酶標(biāo)記鏈親和素)加入每孔室溫反應(yīng) 2h, 加底物 TMBZ顯色, 30min后, 以1 mol/L的H2SO4終止反應(yīng), 在450 nm波長測(cè)定吸光度A450, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計(jì)算樣品MC的濃度。

表1 過濾膜的基本信息Tab. 1 Basic information of different filter membranes in this study

1.4 純水加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

設(shè)置微囊藻毒素 MC-LR和 MC-RR濃度不同(0.005、0.025、0.1、0.25、0.5、1.25 μg/mL)處理組,5 mL體系, 經(jīng)不同濾膜減壓抽濾或?yàn)V器處理后, 取樣1 mL置于1.5 mL棕色樣品瓶中, 待檢測(cè)。

1.5 原水加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

分別取原水水樣(ELISA方法未檢出藻毒素)5 mL, 加入 MC-LR和 MC-RR(濃度分別為 0.25、1.25 μg/mL), 按照1.4中的方法進(jìn)行處理。

1.6 含高濃度藍(lán)藻細(xì)胞樣品預(yù)處理和測(cè)定

采集野外含有藍(lán)藻細(xì)胞的水樣1 L, 4℃保存待用。分別取100 mL水樣, 采用上述濾膜法去除藻細(xì)胞, 濾液混勻后取適量待測(cè)。另外, 比較常規(guī)離心法(離心條件為8000、4000 r/min, 5min, 4℃)去除藻細(xì)胞效率, 并測(cè)定離心后水中MCs含量。以ELISA方法測(cè)定各組處理后MCs的含量。

2 結(jié)果

2.1 純水內(nèi)標(biāo)法

不同濾膜和濾器過濾后回收率如圖 1。在 6個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組中, PES針式過濾器前處理后回收率高于其他處理; 玻璃纖維濾膜(GF/C)回收率顯著高于3種孔徑0.45μm微孔濾膜。圖 1中箭頭所指為3種孔徑0.45μm微孔濾膜處理后, 0.1μg/mL的處理組毒素濃度低于HPLC檢出限。0.1μg/mL以下各組采用ELISA進(jìn)行低濃度藻毒素含量分析。同樣, PES針式小過濾器處理后, MCs的平均回收率在90%以上, GF/C處理后回收率在80%以上。然而其他3種膜處理法的平均回收率相對(duì)較低, 在50%左右。表2為不同膜吸附MCs的飽和吸附量, 數(shù)據(jù)顯示, 每個(gè)PES針式過濾器和 GF/C濾膜的飽和吸附量低于1μg, 而其他3種濾膜吸附藻毒素的能力較強(qiáng), 最高可達(dá)每張CA濾膜吸附279.1μg藻毒素。

2.2 原水內(nèi)標(biāo)法

圖1 純水加入MCs后不同膜過濾處理的回收率Fig. 1 MCs recovery in Milli-Q water after pretreatments with different membranes

原水中存在大量有機(jī)質(zhì), 是否會(huì)干擾膜過濾法制備樣品測(cè)得原水中微囊藻毒素含量？為了回答這一問題, 本研究在不含毒素原水中加入純毒素, 過濾后檢測(cè), 并計(jì)算得MCs回收率如圖2。結(jié)果與純水加標(biāo)回收法相近, 即高濃度毒素的各組處理方法回收率高于低濃度, 3種微孔濾膜(0.45 μm)減壓過濾處理后的回收率顯著低于玻璃纖維膜法和針式濾器處理后的各組。

2.3 藍(lán)藻水華水樣的預(yù)處理和ELISA測(cè)定

為了探究采用不同濾膜過濾法對(duì)含有野外含高濃度藍(lán)藻細(xì)胞水樣中溶解態(tài)藻毒素測(cè)定的影響, 本研究分別對(duì)取自我國太湖和巢湖的樣品進(jìn)行測(cè)定,并系統(tǒng)比較不同處理過程。首先, 采用同樣的過濾膜法前處理水華水樣, 測(cè)定各組濾液中MCs濃度見表3?？梢缘贸? GF/C濾膜法和針式濾器處理組獲得的結(jié)果較為相近, 而其他 3種膜過濾處理組皆未檢出藻毒素。

此外, 通過藻細(xì)胞計(jì)數(shù), 評(píng)估了不同轉(zhuǎn)速離心去除水華水樣中藻細(xì)胞的效率(表4), 并將離心上層液過濾(GF/C 過濾膜法)后, 測(cè)定濾液中 MCs含量(表3)。從表4中可以發(fā)現(xiàn), 即使在離心轉(zhuǎn)速為8000 r/min下, 也很難完全去除水華樣品中藻細(xì)胞。同時(shí), 表3中離心(過濾)組 MCs濃度皆高于其他組, 且較高的離心轉(zhuǎn)速處理后測(cè)定的溶解態(tài) MCs濃度高于低轉(zhuǎn)速處理。因此, 即使是低轉(zhuǎn)速離心處理, 藻細(xì)胞也有破裂的風(fēng)險(xiǎn), 導(dǎo)致藻毒素釋放。

3 討論

膜過濾法在測(cè)定水中溶解態(tài)微囊藻毒素中, 不同材質(zhì)的過濾膜對(duì)于微囊藻毒素的親和力和吸附能力不同, 從而, 過濾膜材質(zhì)選擇至關(guān)重要。對(duì)于目前使用最為廣泛的是玻璃纖維濾膜, 根據(jù)孔徑不同,常見種類有 47 mm A/E 玻璃纖維濾膜(1.0 μm,Gelman Science)[12]、47 mm GF/C 玻璃纖維濾膜(1.2 μm, Whatman)[4,10,13,14]和孔徑為 0.45 μm 的水系濾膜[15]。醋酸纖維濾膜也是一種常見的水系過濾膜, 如液相色譜中常用的 0.22 μm 醋酸纖維濾膜(cellulose-acetate, CA; Axiva, India)[16]。Moran, et al.比較了玻璃纖維濾膜、聚碳酸酯膜和混合纖維素膜在測(cè)定葉綠素 a和初級(jí)生產(chǎn)力中的性能差異, 指出玻璃纖維濾膜對(duì)于DO14C有較強(qiáng)的吸附能力, 使獲得的POC偏高[17]。微囊藻毒素分子雖然是疏水性化合物, 以最常見的 3種結(jié)構(gòu)體為例, 它們的logKow(表征疏水性的參數(shù))分別為 MC-RR(4.4)、MC-LR(4.2)、MC-YR(3.9)。但是分子中含有的羧基和各種氨基酸使其又具有極性化合物的性質(zhì)。微囊藻毒素可溶于水, 并常以水相存在, 所以MCs不易被水體中顆?；蛩樾嘉絒6—8], 卻可能被親水性強(qiáng)的濾膜, 如各種纖維濾膜吸附。

表2 不同過濾膜的飽和吸附量a(微克/每張濾紙)Tab. 2 The adsorption capacity of different membranes (μg/sheet)

表3 野外水華水樣過濾前后MCs含量變化(微克/升)Tab. 3 Changes in microcystins concentrations in water bloom samples before and after pretreatments with different methods (μg/L)

表4 離心前后藻類細(xì)胞密度(×10 cells/L)的變化Tab. 4 Algal cell density(×108 cells/L)before and after centrifugation

微囊藻毒素結(jié)構(gòu)體多達(dá) 85種以上[16], Vasconcelos, et al.指出天然水華水體中大部分為 MC-LR(所占比例為45.5%—99.8%)[9], Marina Aboal, et al.也認(rèn)為MC-LR為主要結(jié)構(gòu)體, 其次為MC-RR[10]。2007年宋立榮等研究指出在中國太湖主要的微囊藻毒素結(jié)構(gòu)體為 MC-RR、MC-LR和 MC-YR。其中MC-RR占 50%以上[1]。所以本研究選取我國自然水體中主要微囊藻毒素異構(gòu)體MC-RR和 MC-LR作為研究對(duì)象。MC-RR分子具有兩個(gè)精氨酸, 且分子量較其他結(jié)構(gòu)體大, 導(dǎo)致這兩種毒素異構(gòu)體在經(jīng)過同樣的樣品制備步驟后回收率存在一定差異, MC-RR的回收率更低, 例如實(shí)驗(yàn)中經(jīng)醋酸纖維濾膜過濾處理后, 其平均回收率只有21%。

對(duì)于含有大量產(chǎn)毒藻細(xì)胞的水樣, 若直接測(cè)定溶解態(tài)MCs的含量, 將會(huì)引起藻細(xì)胞破裂, 胞內(nèi)藻毒素釋放, 導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果顯著偏高。采用離心法去除藻細(xì)胞, 然后測(cè)定上清液中藻毒素濃度, 即為原水中溶解態(tài)藻毒素含量, 然而離心法并不能完全去除藻細(xì)胞, 反而可能導(dǎo)致產(chǎn)毒藻細(xì)胞裂解, 釋放出胞內(nèi)藻毒素, 導(dǎo)致溶解態(tài)藻毒素濃度上升, 無法正確反映原水中溶解態(tài)MCs含量。

總之, 樣品制備過程對(duì)于測(cè)定水柱中溶解態(tài)微囊藻毒素非常重要, 不恰當(dāng)?shù)姆椒ㄍ鶗?huì)使測(cè)得的結(jié)果偏低或者偏高, 導(dǎo)致過度低估或者高估溶解態(tài)微囊藻毒素的潛在風(fēng)險(xiǎn)。而采用PES或GF/C材質(zhì)的濾膜過濾處理水樣較好地去除藻細(xì)胞及其他顆粒態(tài)藻毒素, 同時(shí)避免在樣品制備過程中藻毒素被濾膜吸附, 可以作為樣品制備方法, 更準(zhǔn)確地測(cè)定水體中溶解態(tài)藻毒素。