揣玉多， 馬志剛， 王德培

1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學院，天津 300350;

2.天津科技大學生物工程學院，天津 300457

近十年來，丙酸的需求量猛增，在飼料加工、谷物防霉、食品防腐和農(nóng)藥、醫(yī)藥等方面市場潛力巨大，因此丙酸行業(yè)將有廣闊的開發(fā)前景［1］。目前，丙酸的工業(yè)化生產(chǎn)主要采用化學合成法，但是隨著全球環(huán)境保護意識和能源節(jié)約意識的增強，以及一些歐盟國家擔憂化學合成法生產(chǎn)的丙酸可能存在食品安全問題，近年來，圍繞微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酸開展了大量的研究工作［2～5］。

丙酸發(fā)酵主要通過丙酸桿菌以葡萄糖等作為碳源產(chǎn)丙酸的過程，同時還伴隨有乙酸、琥珀酸、CO2等副產(chǎn)物生成。丙酸桿菌一般由底物經(jīng)EMP途徑，再經(jīng)過Wood-Werkman循環(huán)途徑、乙酸和CO2合成途徑、琥珀酸合成途徑、三羧酸循環(huán)途徑等途徑生成丙酸及副產(chǎn)物，其中乙酸為主要的副產(chǎn)物。乙酸生成的過程中，需要維生素B1作為丙酮酸脫氫酶的輔酶［6］，因此篩選維生素B1營養(yǎng)缺陷型菌株，可使菌株自身合成維生素B1產(chǎn)生乙酸的代謝途徑被阻斷，從而降低菌株生產(chǎn)乙酸的能力，使代謝更多轉(zhuǎn)向丙酸的合成，從而得到高產(chǎn)丙酸的菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種

丙酸桿菌(Propionibacteria freudenreichii)IFFI.10019，由本實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母膏 10 g/L，磷酸銨 5 g/L，pH 7.2 ～7.4，121℃，滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母膏 10 g/L，磷酸銨 5 g/L，碳酸鈣 5 g/L，pH 7.2 ～7.4，121℃，滅菌20min。

細菌完全培養(yǎng)基:牛肉膏 3 g/L，酵母膏3 g/L，蛋白胨3 g/L，葡萄糖5 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.2，113℃，滅菌15 min。

細菌基本培養(yǎng)基:(NH4)2SO42 g/L，葡萄糖5 g/L，檸檬酸鈉 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，K2HPO44 g/L，KH2PO46 g/L，瓊脂粉 20 g/L，113℃，滅菌15 min。

無氮基本培養(yǎng)基:葡萄糖 5 g/L，檸檬酸鈉 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，K2HPO44 g/L，KH2PO46 g/L，113℃，滅菌 15 min。

2倍氮源基本培養(yǎng)基:(NH4)2SO44 g/L，葡萄糖5 g/L，檸檬酸鈉1 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，K2HPO44 g/L，KH2PO46 g/L，113℃，滅菌15 min。

限制培養(yǎng)基:向配制好的液體基本培養(yǎng)基(不含瓊脂)中加入1～5 g/L的完全培養(yǎng)基，加入20 g/L 瓊脂，113℃，滅菌15 min。

1.3 主要儀器

Mettler Toledo Delata 320型pH計，梅特勒·托利多儀器(上海)有限公司;WFJ2000型分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司;GC-7890Ⅱ氣相色譜儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.4 分析方法［7］

1.4.1 生物量測定 比濁法測定發(fā)酵液吸光度A600，取1 mL發(fā)酵液用0.1 mol/L的 HCl稀釋20倍，用WFJ2000型分光光度計在波長600 nm處，光程1 cm比色皿比濁。所測的吸光度代表生物量。

1.4.2 pH測定 測定發(fā)酵液pH，反映發(fā)酵液總含酸量。

1.4.3 丙酸、乙酸含量的測定 采用氣相色譜法測定發(fā)酵液中丙酸和乙酸的含量。色譜條件:不銹鋼色譜柱，GDX-401固定相，色譜柱溫度為200℃，進樣器溫度為 220℃，檢測器溫度為220℃，進樣量1 μL，外標法測定。樣品處理:取1mL發(fā)酵液于 EP管中，加入 0.02 mL 50%H2SO4酸化，10 000 r/min離心3 min，取上清液測定發(fā)酵液中的丙酸含量Xpr(g/L)、乙酸含量XAc(g/L)。

1.5 誘變育種

1.5.1 丙酸桿菌生長曲線的繪制 丙酸菌活化12 h，按1%接種量接種于250 mL三角瓶中(裝液量50 mL)，30℃、120 r/min搖床培養(yǎng)，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為空白對照，0.5～1 h為間隔，測定生物量，繪制丙酸桿菌生長曲線。

1.5.2 菌懸液制備 取培養(yǎng) 20 h的發(fā)酵液，5 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用生理鹽水離心洗滌菌體兩次，用無菌水制成108/mL的菌懸液。

1.5.3 紫外線誘變與中間培養(yǎng) 吸取5 mL菌懸液，置于培養(yǎng)皿(無上蓋)，磁力攪拌，30 cm高處紫外燈(15 W)照射15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s和120 s，分別吸取1 mL誘變處理菌懸液，置于裝有20 mL細菌完全培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃振蕩過夜培養(yǎng)。

1.5.4 淘汰野生型(青霉素法) 吸取10 mL中間培養(yǎng)液，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用生理鹽水離心洗滌菌體兩次，轉(zhuǎn)入10 mL無氮基本培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)6～8 h。將菌液轉(zhuǎn)入10 mL 2倍氮源基本培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)1～2 h，加入青霉素(終濃度為100 U/mL)，30℃培養(yǎng)5～6 h。吸取10 mL菌液，用生理鹽水離心洗滌菌體一次，將菌體充分懸浮于10 mL生理鹽水中。

1.5.5 營養(yǎng)缺陷型的檢出 吸取0.1 mL 1.5.4中制得的菌懸液，涂布于限制培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)48 h。分別在細菌完全培養(yǎng)基和細菌基本培養(yǎng)基平皿的背面劃32個方格。用牙簽從限制培養(yǎng)基平皿上逐個挑取小菌落(野生型形成大菌落，缺陷型為小菌落)，對應(yīng)點接到細菌基本培養(yǎng)基平皿和細菌完全培養(yǎng)基平皿的方格內(nèi)，30℃培養(yǎng)48 h。將在細菌完全培養(yǎng)基平皿上生長，而在細菌基本培養(yǎng)基平皿上相對應(yīng)位置上不生長的菌落，接種到完全培養(yǎng)基斜面，30℃培養(yǎng)24 h，作為營養(yǎng)缺陷型鑒定用菌株。

1.5.6 營養(yǎng)缺陷型菌株的鑒定 取鑒定用菌株斜面1環(huán)，用生理鹽水離心洗滌菌體，將菌體充分懸浮于5 mL生理鹽水中，吸取1 mL，于細菌基本培養(yǎng)基內(nèi)傾注培養(yǎng)，作為待測平板。將待測平板底背面劃分為4個區(qū)域，在培養(yǎng)基表面4個區(qū)域分別貼上蘸有硫胺素(維生素B1)溶液、吡哆醇(維生素B6)溶液、生物素(維生素H)溶液與泛酸(維生素B5)溶液的濾紙片，30℃培養(yǎng)24 h，觀察濾紙片周圍菌落生長情況(只在蘸有維生素B1溶液濾紙片周圍生長的菌株，即為維生素B1缺陷型菌株)。

1.5.7 營養(yǎng)缺陷型菌株產(chǎn)酸性能測定 分別取出發(fā)菌株和營養(yǎng)缺陷性菌株，液體發(fā)酵培養(yǎng)，24 h后測定發(fā)酵液的pH以及乙酸、丙酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙酸桿菌生長曲線的繪制

按照1.5.1的方法培養(yǎng)丙酸桿菌，并測定生長曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，0～2 h處于延滯期，2～24 h處于對數(shù)生長期，生物量驟增，菌體繁殖迅速，24 h后丙酸菌進入平穩(wěn)期，因此選用培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期，即20 h的丙酸菌進行紫外誘變育種。

圖1 丙酸菌生長曲線 Fig.1 Growth curve of Propionibacteria freudenreichii.

2.2 紫外誘變致死曲線的繪制

取出發(fā)菌株搖瓶培養(yǎng)20 h的發(fā)酵液，紫外誘變15～120 s，取不同時間誘變處理菌懸液，避光培養(yǎng)，用傾注法測定存活菌體濃度，繪制丙酸菌紫外誘變致死曲線(圖2)。

由圖2可以看出，紫外照射60 s時，致死率為79%，照射90 s時，致死率已達95%，故在誘變育種時取65 s、70 s、75 s和80 s四個時間進行照射。

2.3 營養(yǎng)缺陷型的檢出與鑒定

經(jīng)紫外線照射65 s、70 s、75 s和80 s后的菌懸液進行中間培養(yǎng)，進一步淘汰野生型，共檢出營養(yǎng)缺陷型菌株16株，編號分別為:Pf001、Pf002、Pf007、Pf010、Pf020、Pf030、Pf033、Pf038、Pf051、Pf083、Pf088、Pf119、Pf134、Pf145、Pf146 和 Pf151。上述16個菌株在30℃培養(yǎng)24 h后，觀察菌株的生長情況，最終鑒定出2株維生素B1的缺陷型菌株，編號為Pf007和Pf088。

圖2 紫外誘變致死曲線 Fig.2 Lethal curve of Propionibacteria freudenreichii by UV.

2.4 維生素B1營養(yǎng)缺陷型菌株產(chǎn)酸性能測定

分別接種發(fā)菌株和營養(yǎng)缺陷性菌株到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，24 h后測定發(fā)酵液的pH以及乙酸、丙酸含量。結(jié)果見表1。

表1 維生素B1營養(yǎng)缺陷型菌株產(chǎn)酸性能 Table 1 Acid production performance of vitamin B1 auxotrophy of Propionibacteria freudenreichii.

紫外誘變篩選出的2株維生素B1營養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵液pH較出發(fā)菌株有所下降，說明產(chǎn)酸量較出發(fā)菌株有所提高。測定發(fā)酵液的pH只能反映發(fā)酵液中H+濃度的高低，而丙酸菌發(fā)酵不僅產(chǎn)生丙酸，還有乙酸、乳酸等有機酸，因此發(fā)酵液的pH變化只能間接說明總產(chǎn)酸量的變化。2株營養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵液中丙酸含量較出發(fā)菌均有很大提高，而乙酸產(chǎn)量明顯下降。其中，Pf007菌株丙酸產(chǎn)量達2.1 g/L，較出發(fā)菌株提高91%，可見通過篩選費氏丙酸菌維生素B1營養(yǎng)缺陷型菌株可以有效改變菌株中的代謝方向，其產(chǎn)丙酸的水平有了明顯的提高，達到了預(yù)期的效果。

3 討論

丙酸菌是一類生長緩慢的微生物，丙酸發(fā)酵是一條較難進行的代謝途徑，屬于典型的間歇厭氧發(fā)酵，通常需7～14 d，發(fā)酵周期長，以葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)丙酸，丙酸產(chǎn)量低，副產(chǎn)物乙酸濃度高。為了提高丙酸的產(chǎn)率，國內(nèi)外研究者積極采用物理化學誘變、基因操作等多種技術(shù)選育理想的丙酸高產(chǎn)菌株［8，9］，并對發(fā)酵方式進行研究，包括固定化細胞［4］、分批補料［10］和連續(xù)發(fā)酵［11］等多種方式，都取得了良好的效果。但對于控制副產(chǎn)物乙酸對丙酸菌發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的影響研究甚少。

本實驗以費氏丙酸菌IFFI.10019為出發(fā)菌，采用紫外誘變育種技術(shù)，選育出2株維生素B1營養(yǎng)缺陷型菌株。維生素B1營養(yǎng)缺陷型丙酸菌降低了菌株內(nèi)源合成維生素B1的能力，進而抑制了乙酸產(chǎn)生途徑，能夠較為顯著地降低乙酸的生成;同時還能夠減少乙酸對菌體生長的抑制［8］，提高發(fā)酵效率。選育獲得的Pf007號菌株發(fā)酵24 h產(chǎn)丙酸水平比出發(fā)菌株有大幅度提高，提高率達到91%，而產(chǎn)乙酸水平比出發(fā)菌也有明顯降低。為進一步提高丙酸產(chǎn)量，下一步將對該菌株進行固定化方法的研究，隔絕菌體與丙酸的直接接觸，解除抑制作用，縮短菌體生長時間，提高細胞重復(fù)使用效率;也可以對該菌株的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。費氏丙酸菌IFFI.10019具備發(fā)酵周期短，培養(yǎng)條件兼性厭氧等利于工業(yè)化生產(chǎn)的特點，本研究為其工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，紫外誘變篩選代謝缺陷突變株的方法為丙酸發(fā)酵生產(chǎn)中副產(chǎn)物乙酸的抑制提供一種新思路。

［1］Stowers C C，Cox B M，Rodriguez B A.Development of an industrializable fermentation process for propionic acid production［J］.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，2014，3:1－16.

［2］Coral J，Karp S G，Porto de Souza Vandenberghe L，et al..Batch fermentation model of propionic acid production by Propionibacterium acidipropionici in different carbon sources［J］.Appl.Biochem.Biotechnol.，2008，151(2 －3):333－341.

［3］Wang Z，Yang S T.Propionic acid production in glycerol/glucose co-fermentation by Propionibacterium freudenreichii subsp.shermanii［J］.Bioresour.Technol.，2013，137:116－123.

［4］陳飛，馮小海，吳 波，等.丙酸桿菌的兩種固定化細胞反應(yīng)器發(fā)酵生產(chǎn)丙酸及其代謝通量分析［J］.化工學報，2011，62(4):1034－1041.

［5］Martinez-Campos R，de la Torre M.Production of propionate by fed-batch fermentation of Propionibacterium acidipropionici using mixed feed of lactate and glucose［J］.Biotechnol.Lett.，2002，24:427－431.

［6］Moo-young M.Comprehensive Biotechnology［M］.New York:Pergamon Press，1985，731－759.

［7］揣玉多，王德培，王艷萍，等.丙酸高產(chǎn)菌株的復(fù)合誘變選育［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(6):45－49.

［8］Suwannakham S，Huang Y，Yang S T.Construction and characterizationof ack knock-out mutants of Propionibacterium acidipropionici for enhanced propionic acid fermentation［J］.Biotechnol.Bioeng.，2006，94(2):383－395.

［9］Hsiu Y Y，Shang T Y.Metabolic Engineering of Priopionibacterium acidipropionici for Enhangced Propionic Acid Fermentation［J］.Appl.Environ.Microbiol.，2003，11(8):2004－2010.

［10］ Zhuge X，Liu L，Shin H D，et al..Improved propionic acid production from glycerol with metabolically engineered Propionibacterium jensenii by integrating fed－batch culture with a pH-shift control strategy［J］.Bioresour.Technol.，2014，152:519－525.

［11］ Goswam V，Srivastava A K.Propionic acid production in an in situ cell retention bioreactor［J］.Appl.Microbiol.Biotechnol，2001，(56):676－680.