董丹丹，徐 鋼，李芳華，胥 穎，李 科，黃 娟

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院病理科，四川 成都 610072;2.瀘州醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，四川 瀘州 646000)

非小細(xì)胞肺癌表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)基因變異最主要的兩種形式是19號外顯子的缺失(E746-A750，15-bp缺失)和21號外顯子858號密碼子發(fā)生的點突變(L858R)［1］，占到肺腺癌患者 EGFR 基因變異的90%以上。EGFR基因狀態(tài)的評估，與肺癌患者治療方案的選擇直接相關(guān)［2］。其最主要的檢測方法是直接測序法和PCR法［3］，但是這些方法復(fù)雜、對實驗室要求高、價格昂貴，在基層醫(yī)院推廣應(yīng)用較難，讓部分患者失去有效治療的機(jī)會。由于胸水中的脫落腫瘤細(xì)胞、細(xì)針穿刺組織、轉(zhuǎn)移部位的樣本是多數(shù)肺癌患者診斷治療及特殊檢測的僅存樣本來源，而肺癌骨轉(zhuǎn)移的患者，由于骨組織經(jīng)過脫鈣處理，造成DNA斷裂，會影響后續(xù)基因檢測結(jié)果，目前已有特異性單克隆抗體可用于標(biāo)記EGFR基因突變蛋白。如果用免疫組織化學(xué)方法檢測EGFR基因突變蛋白的結(jié)果具有可靠性，將為上述患者的基因檢測提供更多的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2010～2013年四川省人民醫(yī)院病理科76例病理診斷為肺腺癌的標(biāo)本，其中男45例(59%)，女31例(41%);年齡≤65歲的患者50例(66%)，年齡＞65歲的患者6例(34%);53例患者無吸煙史(70%)，23例患者目前或以往吸煙(30%)。其中外科手術(shù)標(biāo)本35例，支氣管鏡活檢標(biāo)本39例，胸水脫落細(xì)胞標(biāo)本2例。標(biāo)本來源包括肺(59例)、淋巴結(jié)(5例)、軟組織及腦組織(6例)、胸水(2例)及骨組織(4例)。

1.2 ARMS法檢測EGFR基因突變 5 μm厚的石蠟包埋組織切片3～8張，置于1.5 ml的EP管內(nèi)。采用QIAGEN公司DNA抽提試劑盒，提取樣本DNA，操作按說明書進(jìn)行。DNA質(zhì)量評估及濃度調(diào)整:用分光光度計(3100 pro型，Amersham Biosciences)檢測樣本260 nm與280 nm波長吸光度值，以評價其純度及含量。每例樣本所提DNA均符合OD260/OD280在1.8～2.0，用雙蒸水調(diào)整DNA濃度至 1.5～3 ng/μl。采用廈門艾德 ADx-ARMSTMEGFR基因突變檢測試劑盒，檢測18～21號外顯子共21個突變位點。反應(yīng)體系在ABI 7500實時定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增及數(shù)據(jù)采集。

1.3 EGFR基因突變特異性抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)標(biāo)記 石蠟組織塊切片4 μm厚，切片脫蠟沖洗后，采用PH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)15分鐘，3%的H2O2阻斷組織內(nèi)源性過氧化物酶15分鐘。將切片置入Harris蘇木素染液復(fù)染，自來水洗5分鐘，組織切片浸入0.25%氨水中返藍(lán)，磷酸鹽緩沖液沖洗后，分別滴加特異性一抗，兩種兔單克隆抗體分別特異性識別人類EGFR基因19號外顯子E746-A750缺失(克隆號 6B6;Cell Signaling Technology，Danvers，MA)和21號外顯子 L858R 點突變(克隆號43B2;Cell Signaling Technology)。一抗采用抗體稀釋液進(jìn)行稀釋(稀釋倍數(shù)1∶150)，4℃冰箱孵育過夜。緩沖液沖洗3次，滴加二抗(Dako REALTMEnvisionTMDetection System，Peroxidase/DAB+，Rabbit/Mouse，Code K5007)，置于濕盒中，37 ℃孵育30分鐘，磷酸鹽緩沖液沖洗后滴加新鮮配制的DAB顯色劑，室溫顯色5～10分鐘，顯微鏡下控制顯色時間，自來水充分清洗，梯度酒精脫水后封片液封片。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果評分［4］0分:無著色或 ＜10%腫瘤細(xì)胞有弱的胞質(zhì)和/或胞膜著色;1分:＞10%腫瘤細(xì)胞具有弱的胞質(zhì)和/或胞膜著色;2分:＞10%腫瘤細(xì)胞具有中度胞質(zhì)和/或胞膜著色;3分:＞10%腫瘤細(xì)胞具有具有強(qiáng)的胞質(zhì)和/或胞膜著色。

1.5 ARMS法結(jié)果判定 試劑盒采用8聯(lián)PCR管設(shè)計，每一個8聯(lián)PCR管檢測一個樣品，1～7號管內(nèi)裝有相應(yīng)EGFR基因突變檢測和內(nèi)控試劑，突變探針由FAM信號指示，內(nèi)控由HEX信號指示。內(nèi)控作為對試劑、DNA質(zhì)量及操作本身的質(zhì)控，選擇人類EGFR基因相對保守區(qū)段。待測樣本的內(nèi)控HEX信號升起，同時樣本反應(yīng)管中若有FAM信號升起，則判定相應(yīng)的EGFR基因突變?yōu)殛栃浴?/p>

2 結(jié)果

2.1 ARMS法檢測EGFR基因突變 采用ARMS法檢測EGFR基因狀態(tài)作為標(biāo)準(zhǔn)對照，本組76例原發(fā)或繼發(fā)肺腺癌石蠟組織標(biāo)本，檢出EGFR基因突變28例，其中L858R突變14例，19外顯子缺失病例14例，L861Q突變1例，野生型47例，見圖1。

2.2 免疫組化法測EGFR基因突變

2.2.1 EGFR-L858R突變檢測結(jié)果 采用EGFRL858R特異性抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)標(biāo)記，陽性檢出率為14%，敏感性79%，特異性92%，準(zhǔn)確性92%，陽性預(yù)測值69%，陰性預(yù)測值95%。若陽性閾值定為2+，沒有假陽性病例，敏感性為57%，見圖2。

2.2.2 EGFR基因19號外顯子突變檢測結(jié)果 采用EGFR基因19號外顯子15bp E746-A750缺失特異性抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)標(biāo)記，陽性檢出率為14%，敏感性79%，特異性79%，準(zhǔn)確性79%，陽性預(yù)測值46%，陰性預(yù)測值94%。若陽性閾值定為2+，出現(xiàn)1例假陽性病例，敏感性為50%，見圖3。

2.3 ARMS法與IHC法對比 根據(jù)臨床醫(yī)生需要提供所有的突變結(jié)果，將EGFR-L858R突變和19號外顯子15bp E746-A750缺失特異性抗體免疫組織化學(xué)標(biāo)記的結(jié)果綜合判斷，其陽性檢出率為37%，敏感性79%，特異性79%，準(zhǔn)確性79%，陽性預(yù)測值55%，陰性預(yù)測值95%，見表1、表2。

本組研究共4例肺腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本，通過抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記，結(jié)果檢測4例中有1例存在21號外顯子的L858R突變，其余3例為陰性病例，與AMRS法的檢測結(jié)果一致。胸水脫落細(xì)胞標(biāo)本突變檢測兩種方法均為陰性。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報道亞洲人群肺腺癌患者EGFR基因突變率約為40%［5］。對肺腺癌患者進(jìn)行個體化的治療依賴于臨床對患者基因狀態(tài)進(jìn)行檢測評估［6］。本組ARMS法檢測結(jié)果顯示EGFR基因19、21外顯子總體突變率為37%，與文獻(xiàn)報道結(jié)果相似。然而，分子生物學(xué)方法檢測基因狀態(tài)價格昂貴、結(jié)果判斷復(fù)雜、標(biāo)本要求較高，不能夠在所有醫(yī)院推廣應(yīng)用。對于腫瘤組織過少的穿刺活檢樣本，若不能滿足200個腫瘤細(xì)胞以上的要求，分子水平檢測的敏感度無法達(dá)到識別其是否存在突變。免疫組織化學(xué)檢測對腫瘤細(xì)胞數(shù)量沒有特別要求，且能定位，目前已能在大多數(shù)病理實驗室開展，價格經(jīng)濟(jì)，結(jié)果判讀易于掌握，若適合在臨床推廣應(yīng)用將是分子檢測的有效補(bǔ)充。

Tsai等［7］采用單克隆抗體免疫組織化學(xué)方法檢測78例肺腺癌石蠟組織樣本EGFR基因21外顯子L858R突變和19外顯子 E746-A750缺失，檢測敏感性分別為78%、88%，特異性分別為86%、96%。本組實驗采用EGFR基因21外顯子L858R突變抗體檢測76例非小細(xì)胞肺癌，其敏感性為79%(11/14)，特異性92%(57/62)，陰性預(yù)測值達(dá)95%(57/60);EGFR基因19外顯子 E746-A750缺失蛋白抗體，檢測敏感性為79%(11/14)，特異性79%(49/62)，陰性預(yù)測值達(dá)94%(49/52)。L858R突變特異性蛋白檢測敏感性和特異性稍高于Tsai等［7］的實驗結(jié)果，19外顯子E746-A750缺失蛋白檢測的敏感性和特異性則低于其結(jié)果。EGFR基因19外顯子E746-A750缺失蛋白抗體不能檢測15 bp以外的缺失，這是導(dǎo)致免疫組織化學(xué)檢測敏感性低于ARMS法的原因之一。

圖1 ARMS法檢測EGFR基因 a:19外顯子缺失陽性，樣本S形曲線升起;b:21外顯子L858R突變陽性，樣本S形曲線升起

圖2 L858R突變抗體免疫組織化學(xué)染色 a:弱陽性(×100);b:中度陽性(×100);c:強(qiáng)陽性(×100)

圖3 E746-A750 15 bp缺失抗體免疫組織化學(xué)染色 a:弱陽性(×100);b:中度陽性(×100);c:強(qiáng)陽性(×100)

表1 EGFR突變特異性抗體免疫組織化學(xué)標(biāo)記(IHC)與ARMS法檢測結(jié)果關(guān)系

表2 EGFR突變特異性抗體免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果評價(%)

有作者提出評估免疫標(biāo)記結(jié)果陽性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度可能會提高結(jié)果的敏感性［8］。本組實驗的結(jié)果顯示，若將陽性閾值定為1+，L858R突變抗體、19號外顯子15bp E746-A750缺失抗體檢測的敏感性均為79%，較陽性閾值定為2+，兩種抗體檢測的敏感性(57%、50%)有明顯提高。然而閾值定為1+，假陽性病例隨之出現(xiàn)。本組實驗中，8例免疫組織化學(xué)L858R突變抗體檢測結(jié)果為1+的病例，ARMS法檢測5例為陰性，僅3為突變陽性病例，免疫標(biāo)記出現(xiàn)的假陽性病例占到了63%。19號外顯子15bp E746-A750缺失抗體檢測結(jié)果為1+的病例共16例，12例ARMS法檢測為陰性，僅4為陽性，免疫標(biāo)記出現(xiàn)的假陽性病例占到了75%。但若將陽性閾值定為2+，L858R突變抗體檢出8例陽性病例，無一例假陽性。而19號外顯子15bp E746-A750缺失抗體檢出8例陽性病例，其中一例免疫標(biāo)記結(jié)果3+的病例ARMS法檢測結(jié)果為突變陰性?？梢妼⒚庖邩?biāo)記的陽性閾值定為2+，檢測具有較高特異性(94%，15/16)，然而仍存在6%的假陽性率。

本組實驗L858R突變抗體、19號外顯子缺失抗體免疫標(biāo)記結(jié)果為0的病例，通過ARMS法驗證，假陰性病例分別為5%(3/60)、6%(3/52)，其陰性預(yù)測值分別達(dá)到95%和94%?？梢妰煞N特異性抗體對突變陰性病例檢出的準(zhǔn)確性較高，如果用兩種特異性抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記篩選臨床突變陰性患者會收到令人滿意的結(jié)果。對于無法開展分子水平檢測的醫(yī)院，若采用免疫組織化學(xué)法篩查EGFR基因突變蛋白，檢測結(jié)果為陰性的患者，不宜采用分子靶向藥物治療;突變蛋白檢測為2+及以上的病例，有條件可進(jìn)一步做分子生物學(xué)檢測確診;對于免疫組織化學(xué)檢測為1+的病例，必須做分子生物學(xué)檢測進(jìn)一步明確基因狀態(tài)。本組研究中4例肺腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本，免疫標(biāo)記檢出1例具有21號外顯子的L858R突變，其余3例為突變陰性病例，與AMRS法檢測的結(jié)果一致。說明免疫組織化學(xué)方法能有效檢測骨組織這類經(jīng)過脫鈣處理的樣本。分子水平的檢測方法一般過程較繁瑣、耗時長、實驗室要求高，而免疫組織化學(xué)方法則相對簡單、時間短、對實驗室沒有特殊要求。

本組研究顯示免疫組織化學(xué)方法篩查EGFR特異性突變蛋白的陰性預(yù)測值高，僅能檢測已知突變蛋白，對于L861Q、T790M等具有臨床治療指導(dǎo)價值的突變則不能測定，該方法檢測的敏感性和特異性并不十分令人滿意，如何提高該方法的敏感性和特異性值得更深入的探討。

［1］Sharma SV，Bell DW，Settleman J，et al.Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer［J］.Nat Rev Cancer，2007，7:169-181.

［2］D'Angelo SP，Park B，Azzoli CG，et al.Re ex testing of resected stage I through III lung adenocarcinomas for EGFR and KRAS mutation:report on initial experience and clinical utility at a single center［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，2011，141:476-480.

［3］Pan Q，Pao W，Ladanyi M.Rapid polymerase chain reaction-based detection of epidermal growth factor receptor gene mutations in lung adenocarcinomas［J］.J Mol Diagn，2005，7:396-403.

［4］Brevet M，Arcila M，Ladanyi M.Assessment of EGFR mutation status in lung adenocarcinoma by immunohistochemistry using antibodies speci c to the two major forms of mutant EGFR［J］.J Mol Diagn，2010，12:169-176.

［5］Li AR，Chitale D，Riely GJ，et al.EGFR mutations in lung adenocarcinomas:clinical testing experience and relationship to EGFR gene copy number and immunohistochemical expression［J］.J Mol Diagn，2008，10:242-248.

［6］胡洪林，鄧穎，任剛等.吉非替尼治療晚期非小細(xì)胞肺癌臨床療效分析［J］.實用醫(yī)院臨床雜志，2007，4(5):36-37.

［7］Tzu-Hsiu Tsai，Shang-Gin Wu，Yih-Leong Chang，et al.Effusion immunocytochemistry as an alternative approach for the selection of first-Line targeted therapy in advanced lung adenocarcinoma［J］.Journal of Thoracic Oncology，2012，7:993-1000.

［8］Wu SG，Chang YL，Lin JW，et al.Including total EGFR staining in scoring improves EGFR mutations detected by mutation-speci c antibodies and EGFR TKIs response prediction［J］.PLoS One，2011，6(8):e23303，doi:10.1371.