劉小勇，陳勝龍

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，四川 成都 610500)

研究顯示氧化應(yīng)激在腎缺血再灌注(ischemiaresperfusion，IR)損傷過(guò)程中起重要作用［1～3］，因此，抗氧自由基的產(chǎn)生或及時(shí)清除氧自由基對(duì)改善IR造成的損傷極為重要。丹參是一味重要的活血化瘀藥，其主要有效成分丹參酮ⅡA(TanshineⅡA)對(duì)心、肝、腦、腎器官的缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用［4～6］。參麥注射液是在經(jīng)典方劑生脈飲的基礎(chǔ)上研制而來(lái)，具有益氣養(yǎng)陰、生津止渴以及固脫復(fù)脈的效果，實(shí)驗(yàn)顯示其具有抗氧化應(yīng)激作用［7］。但丹參酮ⅡA聯(lián)用參麥注射液抗氧化效應(yīng)是否增強(qiáng)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以SD大鼠腎IR模型為基礎(chǔ)，以丹參酮ⅡA合用參麥注射液作為干預(yù)手段，測(cè)定腎臟組織中MDA和SOD含量，同時(shí)測(cè)定血肌酐和尿素氮水平，并與單用丹參酮ⅡA和參麥注射液進(jìn)行比較研究，觀察丹參酮ⅡA合用參麥注射液對(duì)IR腎的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠200只，體重200～250 g(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供)。參麥注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào):040803)。丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號(hào):070823)。大鼠MDA、SOD等ELISA試劑盒為R＆D公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及IR模型制備 SD大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組，IR模型組、丹參酮ⅡA組、參麥組及丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組各40只。所有動(dòng)物均先給予標(biāo)準(zhǔn)飲食及自由飲水3d，然后給予藥物處理。丹參酮ⅡA組、參麥組及丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組分別給予丹參酮ⅡA 30 mg/kg、參麥注射液3 ml/kg、丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥注射液(丹參酮ⅡA 30 mg/kg、參麥注射液3 ml/kg)，均于術(shù)前連續(xù)灌胃給藥3 d，每天1次。假手術(shù)組和缺血再灌注組給予等量的生理鹽水灌胃。第4天進(jìn)行手術(shù)，術(shù)前12 h禁食不禁水，4%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，上腹部正中切口進(jìn)入腹腔，推開(kāi)腸腔，暴露左側(cè)腎蒂，用無(wú)損傷微動(dòng)脈夾夾閉腎動(dòng)靜脈50 min后松開(kāi)血管夾使血液復(fù)流進(jìn)行再灌注。觀察腎臟顏色變化情況(若復(fù)流不暢則終止實(shí)驗(yàn))，并于左腎開(kāi)放血流前2 min時(shí)切除右腎，然后縫合關(guān)閉切口。假手術(shù)組按同樣步驟切除右腎，只是不鉗夾阻斷腎蒂血流。術(shù)后僅12 h、24 h組繼續(xù)原方案給藥。三組于術(shù)后3、6、12 h和24 h分別處死10只大鼠，常規(guī)分離血清，置于－80℃冰箱保存以備檢測(cè)。取腎臟組織2.5 g制成勻漿，離心后取上清液置于－80℃冰箱保存待測(cè)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定 腎臟組織中MDA及SOD含量的測(cè)定嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行定量測(cè)定。血清中Cr和BUN水平應(yīng)用本院檢驗(yàn)科的全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織勻漿中MDA含量變化 在IR模型組中，腎組織勻漿MDA水平隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，12 h達(dá)高峰后下降，在6 h和12 h與其它組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而丹參酮ⅡA組、參麥組、丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組和假手術(shù)組中MDA水平無(wú)此變化，且四組相互比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 腎臟組織勻漿中SOD活性變化 隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，腎組織勻漿SOD活性顯著降低，于24 h達(dá)最低水平。丹參酮ⅡA組、參麥組在24 h、丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組在12 h和24 h與IR模型組相比不同程度地提高SOD的活力(P＜0.05)，與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組與丹參酮ⅡA組和參麥組相比在24 h SOD活力提高(P＜0.05);丹參酮ⅡA組與參麥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)段腎臟組織中MDA和SOD活性水平

2.3 血Cr和BUN水平的變化 IR模型組、丹參酮ⅡA組、參麥組和丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組大鼠血Cr和BUN水平隨病程進(jìn)展逐漸升高，各時(shí)點(diǎn)與假手術(shù)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。丹參酮ⅡA組、參麥組和丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組與IR組比較，血Cr和BUN水平低于IR組(P＜0.05);丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組與丹參酮ⅡA組和參麥組比較，在24 h血Cr和BUN值均降低明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而丹參酮ⅡA組與參麥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

3 討論

腎缺血再灌注損傷(ischemia-resperfusion injury，IRI)是臨床常見(jiàn)的病理生理過(guò)程，是導(dǎo)致缺血性急性腎衰竭的主要原因之一，病死率很高，即便存活的患者亦有部分轉(zhuǎn)變?yōu)榻K末期腎臟疾病。因此，如何減輕或避免腎IRI已經(jīng)成為臨床醫(yī)師必須高度重視的問(wèn)題。氧自由基增多導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷在缺血再灌注損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。缺血后急性腎衰竭時(shí)，氧自由基大量產(chǎn)生主要來(lái)源于黃嘌呤氧化酶途徑，腎缺血后ATP降解生成大量的次黃嘌呤，再灌注后由于恢復(fù)供氧，次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶催化下生成黃嘌呤，同時(shí)產(chǎn)生大量的氧自由基和羥自由基，這些氧自由基主要通過(guò)膜的脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)組織造成損害，即對(duì)生物膜中多價(jià)不飽和脂肪酸進(jìn)行降解，而損害細(xì)胞膜和線粒體膜的結(jié)構(gòu)和功能，造成各種細(xì)胞功能障礙。腎臟在缺血再灌注損傷時(shí)，由于其細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜由大量的多不飽和脂肪酸構(gòu)成，所以對(duì)氧自由基介導(dǎo)的損傷特別敏感。MDA是氧自由基與脂質(zhì)過(guò)氧化的分解產(chǎn)物，可與體內(nèi)多種物質(zhì)發(fā)生交聯(lián)而引起損害，因此，測(cè)定MDA不僅可以反映氧自由基的生成，還可間接反映細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度［8］。缺血-再灌注時(shí)MDA含量越高，體內(nèi)脂質(zhì)氧化程度越高，組織損傷越重。SOD是生物體內(nèi)防御氧化損傷的一種十分重要的金屬酶，對(duì)氧自由基有強(qiáng)烈清除作用［9］。

表2 各組大鼠不同時(shí)段血清Cr和BUN水平

實(shí)驗(yàn)顯示，丹參主要有效成分丹參酮ⅡA對(duì)心、肝、腦、腎器官的缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用［4～6］;參麥注射液具有抗氧化應(yīng)激作用［7］。臨床研究顯示，聯(lián)用丹參酮ⅡA和參麥注射液對(duì)缺血性心臟病有明顯改善作用［10］。本實(shí)驗(yàn)觀察到:IRI時(shí)，腎組織勻漿MDA含量隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，于12 h達(dá)高峰，單用丹參酮ⅡA、參麥注射液或二者聯(lián)用均可拮抗IRI時(shí)MDA水平的增高，表明在IR中，丹參酮ⅡA、參麥注射液、丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥注射液對(duì)脂類(lèi)過(guò)氧化均有阻止效應(yīng)，可以降低氧自由基水平。為確定IRI時(shí)，丹參酮ⅡA和參麥注射液的抗氧化作用是否參與了細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除酶活性的調(diào)節(jié)，我們檢測(cè)了氧自由基清除酶SOD活性。發(fā)現(xiàn)與IR模型組相比，丹參酮ⅡA組、參麥組在24 h、丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組在12 h和24 h提高SOD的活力，與假手術(shù)組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組與丹參酮ⅡA組和參麥組相比在24 h SOD活力提高，表明丹參酮ⅡA、參麥注射液、丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥注射液由于增高了氧自由基清除酶SOD活性，從而清除了IRI時(shí)增多的氧自由基，使氧自由基水平降低，其介導(dǎo)產(chǎn)生的MDA水平減少，且聯(lián)用丹參酮ⅡA和參麥注射液優(yōu)于單用效應(yīng)。丹參酮ⅡA組，參麥組，尤其是丹參酮ⅡA聯(lián)合參麥組腎功能受到影響的程度和IR模型組相比均明顯降低，說(shuō)明丹參酮ⅡA、參麥注射液，尤其聯(lián)用丹參酮ⅡA和參麥注射液對(duì)腎臟IRI具有保護(hù)作用。

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