謝蔓菁，陳文霞，黃 楊，李康婧

(廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣西南寧 530021)

牙髓組織對(duì)于維持牙齒作為一個(gè)有活力組織器官的內(nèi)部穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵性作用。臨床上對(duì)不可逆性牙髓炎的治療通常采用根管治療術(shù)，但根管治療后的牙齒由于失去牙髓的營(yíng)養(yǎng)來源，常存在脆性變大、容易折裂等問題［1－2］。近年來，關(guān)于牙髓再生的研究已成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)，并利用干細(xì)胞移植技術(shù)在體內(nèi)外成功構(gòu)建出牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)。然而，干細(xì)胞移植存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，有研究發(fā)現(xiàn)體外擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞在動(dòng)物移植模型中可引起腫瘤的發(fā)生［3－4］。細(xì)胞遷移是損傷修復(fù)的前提，而生長(zhǎng)因子則在干細(xì)胞的遷移、增殖、分化過程中起到重要作用。

BMSCs是存在于骨髓中的一類成體干細(xì)胞，具有多向分化的潛能，且細(xì)胞生物學(xué)特性與牙源性干細(xì)胞有諸多相似之處［5］。有研究證實(shí)，BMSCs在適宜的微環(huán)境中可被誘導(dǎo)分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞［6］。有文獻(xiàn)報(bào)道，在富血小板血漿中加入激活劑后可形成一種膠凍狀的半固體，即富血小板血漿凝膠(Platelet richplasmagel，PRG)，其主要結(jié)構(gòu)為纖維蛋白網(wǎng)和血小板［7］。另有研究發(fā)現(xiàn)，在PRP形成PRG過程中，血小板可通過脫顆粒作用，釋放出多種對(duì)細(xì)胞趨化、增殖、多向分化起促進(jìn)作用的生長(zhǎng)因子［8］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同濃度PRG析出液作用不同時(shí)間對(duì)BMSCs遷移的促進(jìn)作用，以期為后續(xù)研究中利用PRG析出液趨化種子細(xì)胞進(jìn)入根管介導(dǎo)牙髓再生奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

CO2孵育箱(Thermo，美國);相差顯微鏡及其照相系統(tǒng) (Olympus，日本);高溫低速離心機(jī)(Sigma，美國);全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(深圳);細(xì)胞培養(yǎng)皿、板(Corning，美國);Transwell培養(yǎng)小室(Millipore，美國);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone，美國);2.5g/L EDTA－胰蛋白酶(北京索萊寶);牛凝血酶(Sigma，美國)。

1.2 犬BMSCs的分離培養(yǎng)及其成骨分化鑒定

1.2.1 犬BMSCs分離培養(yǎng)

取6個(gè)月家犬1只(體質(zhì)量約為4 kg)，在戊巴比妥鈉腹腔注射(30 mg/kg)麻醉下，自脛骨上端穿刺抽取骨髓置于含肝素的試管中，加入等體積PBS并充分混合后，室溫下離心(1000 r/min)15 min;沉淀部分用DMEM完全培養(yǎng)液重懸后接種于25 mL培養(yǎng)瓶，置于37℃培養(yǎng)箱中在50 mL/L CO2飽和濕度下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)接近80%融合時(shí)，按1∶3進(jìn)行首次傳代，隔日換液;待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80% ～90%融合時(shí)再次傳代。

1.2.2 犬BMSCs成骨分化鑒定

取第3代BMSCs按1×106/mL的細(xì)胞濃度接種于成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基(1 mmol/L地塞米松、1 mol/L β－甘油磷酸鈉、50 mmol/L抗壞血酸)，37℃，50 mL/L CO2飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)3周后，分別進(jìn)行堿性磷酸酶、茜素紅、Von kossa染色，倒置顯微鏡下觀察BMSCs經(jīng)過成骨誘導(dǎo)后堿性磷酸酶的表達(dá)以及鈣結(jié)節(jié)形成情況。

1.3 PRG析出液的制備

1.3.1 PRP 提取

取上述同一只實(shí)驗(yàn)犬并以相同的方法麻醉后，無菌條件下采集靜脈血，用低溫高速離心機(jī)在控溫20℃條件下兩次離心:第1次離心(2400 r/min，10 min)后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)分別吸取全部血漿層、白膜層及其下2～3 mm的紅細(xì)胞層，并移入另一無菌離心管內(nèi)進(jìn)行第2次離心(3600 r/min，15 min)，吸棄上層3/4貧血小板血漿，將余下的1/4血漿層、白膜層以及紅細(xì)胞層混勻后即為PRP。然后立即對(duì)全血及PRP進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。

1.3.2 制備PRG析出液

將PRP與激活劑(牛血酶及10%CaCl2混合物)按體積比為9∶1的比例混合，震蕩混勻后室溫下靜置1 h，再置于4℃冰箱過夜。待PRP凝膠大部分收縮后，以5000 r/min速度離心10 min，并吸取富含復(fù)合生長(zhǎng)因子的PRG析出液分裝于1.5 mL EP管內(nèi)，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 BMSCs遷移實(shí)驗(yàn)

1.4.1 觀察PRG析出液對(duì)BMSCs遷移影響的濃度效應(yīng)

取第3代BMSCs接種于無血清培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng)8 h后，用DMEM培養(yǎng)液制備細(xì)胞密度為1×106/mL的單細(xì)胞懸液。取帶有Transwell小室的24孔板，并于每個(gè)小室的上室內(nèi)各加入100 mL BMSCs單細(xì)胞懸液，然后將其隨機(jī)分為6組(5個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組)(每組復(fù)3孔);然后在5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的下室內(nèi)分別加入含PRG析出液體積分?jǐn)?shù)為1%、5%、10%、20%、50%的DMEM培養(yǎng)液(含1%血清)600 μL，對(duì)照組加入等量?jī)H含1%血清的DMEM培養(yǎng)液標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，取出各組所有Transwell小室，棄去上室培養(yǎng)液并用PBS浸洗2 min;棉簽輕柔拭去小室濾膜內(nèi)表面未遷移的細(xì)胞后，將外表面遷移有細(xì)胞的濾膜置于40 g/L多聚甲醛溶液條件下固定10 min;然后蒸餾水洗滌3 min×2次，10 g/L結(jié)晶紫染色10 min;蒸餾水漂洗5 min后自然晾干，顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞，并于每張濾膜上各隨機(jī)選取5個(gè)視野(100×)計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)，取其平均值［9］。重復(fù)3次。

1.4.2 觀察PRG析出液對(duì)BMSCs遷移影響的時(shí)間效應(yīng)

取3塊帶有Transwell小室的24孔板，并于每個(gè)Transwell小室的上室內(nèi)各加入100 μL第3代BMSCs單細(xì)胞懸液(制備方法和細(xì)胞密度同1.4.1)，并將其隨機(jī)分為兩組:實(shí)驗(yàn)組下室內(nèi)加入含PRG析出液濃度為5%的DMEM培養(yǎng)液(含1%血清)600 μL;對(duì)照組下室內(nèi)加入等量?jī)H含1%血清的DMEM培養(yǎng)液。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后12、24、36 h各時(shí)間點(diǎn)，每組各取出3個(gè)Transwell小室，按1.4.1相同的方法進(jìn)行細(xì)胞固定、染色和顯微鏡下觀察，并對(duì)穿膜細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察

BMSCs原代培養(yǎng)第5天時(shí)，貼壁細(xì)胞散在分布于培養(yǎng)瓶底部，并呈圓形、多角形、梭形外觀(圖1a);培養(yǎng)10～12 d后，細(xì)胞融合成片，基本貼滿培養(yǎng)瓶底部。傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于一致，排列規(guī)律有序，呈放射狀或漩渦樣生長(zhǎng)，增殖速度較原代細(xì)胞快(圖1b)。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×40)

2.2 BMSCs成骨分化鑒定結(jié)果

BMSCs成骨誘導(dǎo)3周后堿性磷酸酶染色可見細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)均有陽性反應(yīng)，染色呈藍(lán)黑色顆?；驂K狀深染顆粒(圖2a);茜素紅染色可見染色陽性的桔紅色鈣結(jié)節(jié)(圖2b);Von kossa染色可見染色陽性的黑色鈣結(jié)節(jié)(圖2c)。

2.3 PRP中血小板含量及PRG析出液的含量

二次離心所得PRP中血小板的含量為(953.33±64.53)×109/L，全血中血小板的含量為(208.66±13.57)×109/L，與全血相比，PRP 中血小板濃度明顯升高(P＜0.05)。10 mL靜脈全血制備的 PRP約可制備出0.7 mL的 PRG析出液(圖3)。

圖2 BMSCs成骨分化鑒定結(jié)果(×40)

2.4 不同濃度PRG析出液對(duì)BMSCs遷移的影響

與對(duì)照組相比，1%、5%、10%、20%不同濃度PRG析出液均能明顯促進(jìn)BMSCs的遷移(P＜0.05);其中以5%濃度組的促進(jìn)作用最強(qiáng);此后隨著PRG析出液濃度的升高，對(duì)BMSCs遷移的促進(jìn)作用逐漸降低，當(dāng)其濃度達(dá)50%時(shí)，小室濾膜外表面已觀察不到穿膜細(xì)胞;不同濃度PRG析出液組遷移細(xì)胞數(shù)量?jī)蓛上啾龋町惥薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(表1，圖 4)。

圖3 富血小板血漿凝膠析出液的制備

表1 各組BMSCs的遷移數(shù)比較 (n=3)

2.5 5%PRG析出液促進(jìn)BMSCs遷移的時(shí)間效應(yīng)

與對(duì)照組相比，5%PRG析出液作用于BMSCs 12、24、36 h不同時(shí)間均能明顯促進(jìn)其遷移(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)的遷移細(xì)胞數(shù)以12 h最低，與24、36 h組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);作用24 h的遷移細(xì)胞數(shù)最高，但與36 h相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖5，表2)。

圖4 不同濃度PRG析出液組的BMSCs遷移情況(×100)

圖5 5%PRG析出液作用于BMSCs不同時(shí)間后的細(xì)胞遷移情況(×40)

表2 5%PRG析出液促進(jìn)BMSCs遷移的時(shí)間效應(yīng)

3 討論

Dimitris等(1984)發(fā)現(xiàn)血漿中提取的PRP經(jīng)激活后可使其中的血小板釋放出多種生長(zhǎng)因子以來，學(xué)者們對(duì)PRP的成分、生物學(xué)作用以及臨床應(yīng)用等均進(jìn)行了大量研究;并發(fā)現(xiàn)其含有機(jī)體損傷修復(fù)所需的多種生長(zhǎng)因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF－β)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等［10］。Garg等［11］報(bào)道，在 PRP中加入促凝劑后，不僅可激活血小板使之釋放生長(zhǎng)因子，同時(shí)還能激活纖維蛋白使其形成具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，該凝膠的特殊結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞黏附、增殖、分化，更能充分發(fā)揮其生物學(xué)作用。

本研究通過Transwell實(shí)驗(yàn)觀察了PRP激活后形成的凝膠析出液對(duì)BMSCs遷移的促進(jìn)作用，結(jié)果顯示:培養(yǎng)基中的PRG析出液濃度在1%～20%時(shí)，可明顯促進(jìn)BMSCs的遷移，其中以5%濃度組的促進(jìn)遷移作用最佳;此后隨著PRG析出液濃度的增加促進(jìn)遷移作用越來越低，當(dāng)濃度達(dá)到50%時(shí)，已觀察不到遷移的細(xì)胞。本結(jié)果與相關(guān)研究類似，Marx等［12］認(rèn)為，PRP內(nèi)的血小板濃度為全血血小板濃度的4～5倍時(shí)，才會(huì)有明顯的生物學(xué)作用，低于此范圍，其作用不顯著;高于此范圍，其作用也不會(huì)得到增強(qiáng)，甚至?xí)鸬揭种七w移的作用。Weibrich等［13］在研究PRP中的血小板濃度對(duì)種植體周圍骨再生的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PRP內(nèi)血小板的濃度為全血血小板濃度的2～6倍時(shí)，才會(huì)對(duì)種植體周圍骨再生起到明顯的促進(jìn)作用，而當(dāng)其濃度為6～11倍時(shí)，則會(huì)對(duì)成骨細(xì)胞的活性起抑制作用;作者在分析引起這一現(xiàn)象的原因時(shí)認(rèn)為，當(dāng)其濃度過高時(shí)細(xì)胞因子可能會(huì)表現(xiàn)出細(xì)胞毒性所致。此外，Marden［14］也報(bào)道了高劑量的 PDGF－BB 能抑制骨生成。分析其原因:①細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的發(fā)生是由析出液中生長(zhǎng)因子配體與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合后所啟動(dòng)，但細(xì)胞膜上的受體數(shù)量有限，當(dāng)生長(zhǎng)因子濃度升高到一定程度時(shí)，受體與配體數(shù)量恰好匹配，即能發(fā)揮最佳促遷移效果，若超過該濃度閾值時(shí)，則會(huì)出現(xiàn)受體飽和反饋抑制，從而導(dǎo)致遷移細(xì)胞數(shù)逐漸降低甚至觀察不到細(xì)胞的遷移;②當(dāng)PRG析出液的濃度過大時(shí)，其中所含有的高濃度生長(zhǎng)因子會(huì)表現(xiàn)出細(xì)胞中毒，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，使之無法遷移小室的濾膜外表面。此外，本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，PRG析出液對(duì)BMSCs的遷移作用具有時(shí)間依賴性，即5%的 PRG析出液作用于 BMSCs 24 h組的促遷移作用最佳，但其具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

［1］Dammaschke T，Steven D，Kaup M，et al.Longterm survival of root－ canal－ treated teeth:a retrospective study over 10 years［J］.J Endod，2003，29(10):638－643.

［2］Andreasen JO，F(xiàn)arik B，Munksgaard EC.Long－term calcium hydroxide as a root canal dressing may increase risk of root fracture［J］.Dent Traumatol，2002，18，134 －137.

［3］So R，Augello A，Carida M，et al.Developmentof sarcomasin mice implanted with mesenchymal stem cells seeded onto bioscaffolds［J］.Carcinogenesis，2009，30(1):150 －157.

［4］Olar J，Nauta AJ，Osborn MJ，et al.Sarcoma derived from cultured mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells，2007，25(2):371－379.

［5］Huang GT，Gronthos S，Shi S.Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs.those from other sources:their biology and role in regenerative medicine［J］.J Dent Res，2009，88(9):792 －806.

［6］董金山，段晴月，文軍，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化的體外實(shí)驗(yàn)研究［J］.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2010，20(4):192 －195.

［7］馬健，李放，任大江，等.富含血小板血漿凝膠的超微結(jié)構(gòu)［J］.中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2011，17(3):223－225.

［8］Ennis JPM，Stoelinga PJW，Jansen JA.Mandibular reconstruction:a clinical and radiographic animal study on the use of autogenous scaffolds and platelet－rich plasma［J］.International J Oral Maxillo Facial Rgery，2002，31(3):281 －286.

［9］Lee JJ，Kwak HJ，Lee YM，et al.Acute radio frequency irradiation does not affect cell cycle，cellular migration，and invasion［J］.Bioelectromagnetics，2008，29(8):615 －625.

［10］Nikolidakis D，Jansen JA.The biology of platelet－rich plasma and its application in oral surgery:literature review［J］.Tissue Engineering Part B:Reviews，2008，14(3):249 －258.

［11］Garg AK，Gargenese D，Peace I.Using platelet－rich plasma to develop an autologous membrane for growth factor delivery in dentalimplant therapy［J］.Dent Implantol Update，2000，11(6):41－44.

［12］Marx RE.Platelet－rich plasma:evidence to support its use［J］.J Oral Maxillofac Surg，2004，62(4):489－496.

［13］Weibrich G，Hansen T，Kleis W，et al.Effect of platelet concentration in platelet－rich plasma on peri－implant bone regeneration［J］.Bone，2004，34(4):665 － 671.

［14］Marden LJ，F(xiàn)an RS，Pierce GF，et al.Platelet－derived growth factor inhibits bone regeneration induced by osteogenin，a bone morphogenetic protein，in rat craniotomy defects［J］.J Clin Investigation，1993，92(6):2897.