王孝勛，郭振旺，李耀華，梁臣艷*，梁 丹

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530001;2.廣西壯族自治區(qū)梧州食品藥品檢驗(yàn)所，廣西梧州 543002)

對(duì)葉百部為百部科植物對(duì)葉百部Stemona tuberosa Lour.的干燥塊根，具有潤(rùn)肺下氣止咳、殺蟲(chóng)滅虱的功效，用于新久咳嗽、肺癆咳嗽、百日咳;外用于頭虱、體虱、蟯蟲(chóng)病、陰癢?，F(xiàn)代藥理研究表明百部根的提取物具有抑菌［1］、抗真菌［2］、抗病毒［3］、殺蟲(chóng)［4］、止咳［5］等作用。對(duì)葉百部為《中國(guó)藥典》2005年版、2010年版所收載百部藥材的3個(gè)來(lái)源品種之一［6］，為多基原藥材。但百部項(xiàng)下僅有性狀、鑒別、浸出物等項(xiàng)目，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究較為薄弱，缺乏有效成分的量化評(píng)價(jià)指標(biāo)。對(duì)于多基原藥材應(yīng)分別進(jìn)行研究，制定能反映其內(nèi)在質(zhì)量的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)［7］。生物堿是百部的脂溶性部位的主要成分，同時(shí)也是百部提取物的主要活性成分［8-10］。廣西為對(duì)葉百部的主要產(chǎn)地［11-13］，但未見(jiàn)對(duì)葉百部生物堿成分的定量測(cè)定文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用硅膠柱色譜法、制備液相等分離方法從對(duì)葉百部中分離了氧化對(duì)葉百部堿，并用HPLC法建立了中藥對(duì)葉百部中氧化對(duì)葉百部堿的定量測(cè)定，為完善中藥材對(duì)葉百部的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200分析型高效液相色譜儀 (美國(guó)Aglient公司、DAD檢測(cè)器);LC-8A半制備型高效液相色譜儀 (日本島津公司);RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠);Millipore Simplicity-185超純水儀 (美國(guó)Millipore公司);BP211D型電子分析天平 (德國(guó)Sartorius公司);KQ5200DB超聲波清洗儀 (江蘇昆山市超聲儀器有限公司);X-4數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀 (北京泰克儀器有限公司);柱色譜和薄層色譜用硅膠均系青島海洋化工廠生產(chǎn);乙腈為色譜純 (美國(guó)Fisher公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純;氧化對(duì)葉百部堿對(duì)照品 (自制，純度98.1%)。

對(duì)葉百部藥材采自廣西各地，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物教研室韋松基教授鑒定為百部科百部屬植物對(duì)葉百部Stemona tuberosa Lour.的塊根，標(biāo)本存放于廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。

2 方法與結(jié)果

2.1 氧化對(duì)葉百部堿的提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定取對(duì)葉百部藥材3 kg，粉碎，加乙醇30 L于85℃回流提取2次，每次2 h，提取液過(guò)濾、合并，濾液80℃減壓濃縮成糖漿狀，得稠浸膏約1 kg。稠浸膏用4700 mL 4%鹽酸溶解，酸水液過(guò)濾，濾液加1000 mL氨水調(diào)pH到9，堿水液用三氯甲烷萃取2次 (三氯甲烷總用量4800 mL)，合并三氯甲烷層，三氯甲烷層用水洗滌1次 (水總用量3600 mL)，分取三氯甲烷層，減壓回收三氯甲烷，得總生物堿約30 g，得率為1%。取總生物堿30 g，甲醇溶解，硅膠60 g拌樣;上柱，硅膠600 g(柱徑比1∶9);以三氯甲烷→三氯甲烷-甲醇 (95∶5→90∶10→85∶15)→甲醇梯度洗脫。取三氯甲烷-甲醇 (95∶5)洗脫液，經(jīng)減壓濃縮后得洗脫物約15 g。取洗脫物經(jīng)多次半制備HPLC法和重結(jié)晶，得到無(wú)色細(xì)針狀結(jié)晶22 mg，經(jīng)分析型HPLC分析純度為98.1%。經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定為氧化對(duì)葉百部堿，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 氧化對(duì)葉百部堿結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of oxotuberostemonine

無(wú)色細(xì)針狀結(jié)晶 (甲醇)。mp 89～91℃ (溫度未校正)。薄層顯色反應(yīng):以三氯甲烷-甲醇(80∶20)展開(kāi)，改良碘化鉍鉀顯色為橘紅色。

EI-MS(m/z):389［M］+(44)，360［MC2H5］+(100)，290 ［M-C5H7O2］+(78)。1H-NMR(CD3OD，400MHz)δ:2.05(1H，m，2-Hα)，1.60(1H，m，2-Hβ)，3.65(1H，m，3-H)，3.42(1H，m，5-H)，3.30(1H，m，5-H)，1.85(2H，m，6-H)，1.50(2H，m，7-H)，2.61(1H，t，8-Hα)，2.45(1H，m，8-Hβ)，2.40(1H，m，H-10)，4.26(1H，m，H-11)，3.05(1H，dd，J=8.1，11.7 Hz，12-H)，2.23(1H，m，13-H)，1.35(3H，d，J=7.2，15-H)，1.40(2H，m，16-H)，0.98(3H，d，J=6.6，17-H)，3.98(1H，s，18-H)，2.15(1H，m，19-Hα)，1.80(1H，t，J=10.5，9.9，12.0 Hz，19-Hβ)，2.72(1H，m，20-H)，1.22(3H，d，J=6.9 Hz，22-H)。13C-NMR(CD3OD，100MHz)δ:87.07(C-1)，37.72(C-2)，66.73(C-3)，53.33(C-5)，26.02(C-6)，32.67(C-7)，34.57(C-8)，142.22(C-9)，122.23(C-9a)，42.68(C-10)，67.21(C-11)，38.96(C-12)，52.63(C-13)，181.98(C-14)，15.02(C-15)，27.04(C-16)，9.50(C-17)，85.12(C-18)，34.75(C-19)，36.19(C-20)，181.55(C-21)，13.17(C-22)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［14］報(bào)道基本一致，鑒定為氧化對(duì)葉百部堿。

2.2 色譜條件 Phenomenex Gemini C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相為乙腈-水溶液(45∶55)，體積流量為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)242 nm，柱溫30℃。進(jìn)樣量20 μL。在此色譜條件下，樣品在與對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間出現(xiàn)相同的色譜峰，理論塔板數(shù)4000以上，分離度大于1.5。見(jiàn)圖2。

圖2 氧化對(duì)葉百部堿對(duì)照品及對(duì)葉百部藥材HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of oxotuberostemonine and Stemona tuberose

2.3 對(duì)照品溶液的制備 取氧化對(duì)葉百部堿對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，制得每1 mL含0.141 mg的對(duì)照品貯備液。

2.4 供試品溶液的制備 取干燥對(duì)葉百部樣品粉末約1 g，精密稱定，加入甲醇50 mL，超聲提取40 min，濾過(guò)，濾渣繼續(xù)加入50 mL甲醇，超聲提取40 min，濾過(guò)，合并2次濾液，濃縮定容到2 mL量瓶中。濃縮液經(jīng)10000 r/min離心15 min，即得供試品溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 取氧化對(duì)葉百部堿對(duì)照品貯備液1、2、4、8、10 mL至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。分別取5個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰峰面積。以氧化對(duì)葉百部堿進(jìn)樣量 X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得氧化對(duì)葉百部堿回歸方程為 Y=523.7X-10.57，r=0.9997。結(jié)果表明氧化對(duì)葉百部堿在0.282～2.82 μg之間呈良好的線性關(guān)系。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定氧化對(duì)葉百部堿峰面積，RSD為0.81%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(廣西上思)，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別在0、4、8、12、16、20、24 h注入高效液相色譜儀，測(cè)定氧化對(duì)葉百部堿的峰面積，RSD為0.35%，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批對(duì)葉百部藥材 (廣西上思)約1 g，精密稱定，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄氧化對(duì)葉百部堿的峰面積，計(jì)算，平均含有量為2.67 mg/g，RSD為0.26%，結(jié)果表明本法重復(fù)性較好。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn) 取6份已知含有量的樣品粉末 (廣西上思)，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入與藥材相當(dāng)量的氧化對(duì)葉百部堿對(duì)照品。按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀，記錄氧化對(duì)葉百部堿的峰面積，計(jì)算平均回收率為99.63%，RSD為1.9%。

表1 氧化對(duì)葉百部堿加樣回收考察結(jié)果 (n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

2.6 樣品測(cè)定 分別取10批藥材樣品粉末約1 g，每批樣品平行3份，精密稱定。按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算氧化對(duì)葉百部堿的量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 10批藥材樣品中氧化對(duì)葉百部堿的測(cè)定結(jié)果 (n=3)Tab.3 Determination of oxotuberostemonine in Stemona tuberose(n=3)

3 討論

本研究采用甲醇超聲提取、HPLC法測(cè)定對(duì)葉百部中氧化對(duì)葉百部堿的量，結(jié)果表明10批藥材樣品中均含有一定量的氧化對(duì)葉百部堿，平均含有量為2.99 mg/g。但不同產(chǎn)地的藥材中氧化對(duì)葉百部堿的量相差較大，其中廣西大新最高 (5.83 mg/g)，廣西隆林含有量最低 (0.69 mg/g)，含有量最高值和最低值相差8倍以上，說(shuō)明對(duì)葉百部藥材的質(zhì)量存在較大的差異。這可能與各地土壤狀況、日照強(qiáng)度、栽培條件、栽培時(shí)間、采集季節(jié)等因素有關(guān)，原因有待進(jìn)一步探討。

對(duì)葉百部是《中國(guó)藥典》收載的百部品種來(lái)源之一，其成分研究比較深入，報(bào)道較多，但現(xiàn)行藥典中尚無(wú)成分定量測(cè)定，有關(guān)氧化對(duì)葉百部堿的定量測(cè)定也未見(jiàn)報(bào)道，本研究以各產(chǎn)地藥材中制備分離得到的共有化合物氧化對(duì)葉百部堿為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，該方法簡(jiǎn)單、可行，可在一定程度上反映對(duì)葉百部藥材的質(zhì)量，可以考慮以其為對(duì)照品，評(píng)價(jià)其質(zhì)量。為保證評(píng)價(jià)方法的科學(xué)性和可操作性，應(yīng)考慮深入研究氧化對(duì)葉百部堿的生源途徑、理化性質(zhì)、穩(wěn)定性及其藥效。

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