張幸福，范瑩瑩，王 菲，楊鳳梅，駱桂法，劉海青

(青海省食品藥品檢驗(yàn)所，青海西寧 810016)

九味羌活方出自金代名醫(yī)張?jiān)兀笤t(yī)家王好古師從張?jiān)刂嚼铌綄W(xué)醫(yī)，首次將九味羌活湯錄于《此事難知》一書中［1］。具解表散寒，祛風(fēng)除濕之功效［2］，為風(fēng)寒感冒的首選良藥。經(jīng)現(xiàn)代制藥技術(shù)制成九味羌活丸 (大蜜丸、小蜜丸、濃縮丸、水丸)和九味羌活顆粒［3-4］，在2009年收入國(guó)家基本藥物目錄。該系列制劑處方相同，由羌活、防風(fēng)、蒼術(shù)、黃芩、川芎、地黃、細(xì)辛、白芷和甘草等九味中藥材組成。方中羌活、白芷均含有紫花前胡苷和異歐前胡素，為兩味藥材的主要成分［5-7］和活性成分［8-10］，查閱文獻(xiàn)尚無該系列制劑中紫花前胡苷的測(cè)定方法［11-14］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高效液相色譜梯度洗脫，對(duì)九味羌活5種劑型的紫花前胡苷和異歐前胡素進(jìn)行了定量測(cè)定，方法涵蓋市售的九味羌活系列的全部品種，可以為九味羌活制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

島津LC-20ATVP型高效液相色譜儀，Sartrious BT224S電子天平 (德國(guó) Sartrious公司)，Ohaus AR5120電子天平 (奧豪斯公司)，Hangping FA1004電子天平 (上海天平儀器廠)，超聲波清洗器 (KQ5200B，功率200 W，頻率40kHz，昆山市超聲儀器有限公司)。

紫花前胡苷、異歐前胡素 (供含量測(cè)定用，批號(hào)111821-201001、110827-201008，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院)。液相用甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純 (市售)，水為超純水。九味羌活系列制劑樣品來自生產(chǎn)企業(yè)、經(jīng)營(yíng)單位及使用單位，包括大蜜丸、小蜜丸、濃縮丸、水丸和顆粒劑共5種劑型24批次。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［13-16］Diamonsil C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相A相為乙腈，B相為0.5% 冰乙酸水溶液，梯度洗脫 (0～35 min，10%→50%A;35～50 min，50%A→55A%;50～60 min，55%→80%A);柱溫30℃;體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm;進(jìn)樣量10 μL;記錄時(shí)間60 min。理論塔板數(shù)按異歐前胡素峰計(jì)算不低于2000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取紫花前胡苷0.01173 g置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得紫花前胡苷對(duì)照品貯備液。精密稱取異歐前胡素對(duì)照品0.01053 g(純度99.4%)置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得異歐前胡素對(duì)照品貯備液。精密量取紫花前胡苷貯備液5.0 mL，異歐前胡素貯備液1.0 mL置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得 (每1 mL含紫花前胡苷23.46 μg、異歐前胡素8.37 μg)。

2.3 供試品溶液的制備 取各九味羌活制劑，研細(xì)混勻 (大蜜丸剪成細(xì)小碎粒)，取1 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 專屬性試驗(yàn) 根據(jù)九味羌活制劑的處方，取除去羌活和白芷的樣品，照“2.3”項(xiàng)方法制備陰性供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液、供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。供試品色譜中，在與紫花前胡苷、異歐前胡素對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上，有保留時(shí)間相同的色譜峰，陰性無干擾，見圖1。

圖1 九味羌活制劑的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Jiuwei Qianghuo preparations

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取紫花前胡苷對(duì)照品貯備液 (0.2346 mg/mL)20 mL，置50 mL量瓶中，甲醇定容搖勻 (93.84 μg/mL)，取異歐前胡素貯備液 (41.87 μg/mL)適量，逐步稀釋成含紫花前胡苷質(zhì)量濃度為 0.938、2.815、7.507、18.768、37.536、46.920 μg/mL，異歐前胡素質(zhì)量濃 度 為 1.256、2.512、4.187、8.374、12.561、16.748 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取10 μL，按“2.1”項(xiàng)條件，注入色譜儀測(cè)定，以進(jìn)樣量 (ng)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸處理，得紫花前胡苷回歸方程為Y=2.659×103X －2.539×103，r=0.9999;異歐前胡素回歸方程為 Y=1.660×103X－38，r=0.9999，紫花前胡苷在9.38～469.20 ng、異歐前胡素在12.56～167.48 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 定量限和檢出限 檢出限是指從背景干擾中區(qū)分出被測(cè)物的最低質(zhì)量濃度。進(jìn)1針甲醇，測(cè)出噪音的峰高，取紫花前胡苷和異歐前胡素對(duì)照品溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋進(jìn)樣測(cè)出峰高，按3倍和10倍信噪比計(jì)算出紫花前胡苷和異歐前胡素的檢出限分別為0.28、1.34 μg/mL，定量限分別為0.75、2.51 μg/mL。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取九味羌活水丸，按選定方法制備供試品溶液，室溫下保存，分別于配置后0、3、5、10、18、49 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)條件，注入液相色譜儀，測(cè)定并記錄色譜圖，考察其穩(wěn)定性。紫花前胡苷峰面積的RSD為0.7%，異歐前胡素峰面積的RSD為0.6%。

2.8 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，測(cè)定紫花前胡苷峰面積的RSD為1.5%、異歐前胡素峰面積的RSD為1.2%，表明精密度好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次九味羌活制劑樣品，平行6份，取約1 g，精密稱定，照“2.3”項(xiàng)方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果紫花前胡苷的RSD為1.6%，異歐前胡素的RSD為1.7%。

2.10 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，取已知含有量的九味羌活水丸 (紫花前胡苷為1.2549 mg/g、異歐前胡素為0.4753 mg/g)約0.5 g，平行6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入紫花前胡苷 (15.26 μg/mL)、異歐前胡素對(duì)照品溶液(5.024 μg/mL)50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。按上述測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率考察結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.11 樣品測(cè)定 取九味羌活制劑樣品，照“2.3”項(xiàng)方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算紫花前胡苷、異歐前胡素的量。測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination results of samples

3 討論

3.1 黃芩、羌活、川芎、白芷、蒼術(shù)和地黃等六味藥材的特征峰在此色譜系統(tǒng)中均能體現(xiàn)，因此該系統(tǒng)分析時(shí)間較長(zhǎng)。由于處方藥材多，成分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)只選取紫花前胡苷和異歐前胡素進(jìn)行定量測(cè)定，嘗試用甲醇-0.1% 磷酸溶液、乙腈-0.5%冰乙酸溶液等多種流動(dòng)相，最后選擇甲醇-0.1%冰乙酸為流動(dòng)相梯度洗脫，在該條件下被測(cè)組分的峰形和分離度良好。本實(shí)驗(yàn)共測(cè)定不同生產(chǎn)企業(yè)的水丸11批，濃縮丸2批，大蜜丸4批，小蜜丸2批，顆粒劑5批，并以紫花前胡苷和異歐前胡素的總量來分析比較。

3.2 白芷的主要藥效成分為揮發(fā)性成分，揮發(fā)性成分在放置過程中極易損失。紫花前胡苷和異歐前胡素的總量在大蜜丸、小蜜丸、濃縮丸中相對(duì)穩(wěn)定。在水丸中二者總量差異明顯，既表現(xiàn)在同一企業(yè)內(nèi)，也表現(xiàn)在不同企業(yè)間。而在顆粒劑中的單獨(dú)含有量及總量均較低。

3.3 水丸和蜜丸均為藥材細(xì)粉用水泛丸或加煉蜜制丸;顆粒劑和濃縮丸中羌活、防風(fēng)、蒼術(shù)、細(xì)辛、川芎提取揮發(fā)油，白芷進(jìn)行滲漉 (顆粒劑)或部分原粉 (濃縮丸)。同為噴入揮發(fā)油，濃縮丸中紫花前胡苷和異歐前胡素的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于顆粒劑。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，歐前胡素長(zhǎng)時(shí)間受熱會(huì)損失高達(dá)40%［17］。曲永勝［18］認(rèn)為揮發(fā)油是否影響九味羌活顆粒的療效，需要進(jìn)一步更深入的研究。目前對(duì)藥物中揮發(fā)油的穩(wěn)定性研究以 β-環(huán)糊精包合為主［19-21］。

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