劉 寧 高建民 劉 鵬 陸 地 尹偉力 段效輝

（煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局 山東煙臺(tái) 264000）

1 前言

食品輻照技術(shù)作為一種安全環(huán)保的食品滅菌保鮮技術(shù)，理論上可以應(yīng)用于所有食品，經(jīng)過輻照處理的食品可長期保存，便于長途運(yùn)輸、國際貿(mào)易及特殊用途的需要。至2010年底，已有42個(gè)國家核準(zhǔn)了240多種輻照食品，年銷量逾30萬t[1]。雖然聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）、世界衛(wèi)生組織（WHO）和國際原子能機(jī)構(gòu)（IAEA）認(rèn)為，在10KGy劑量以內(nèi)輻照任何食品不會(huì)引起毒理學(xué)危害[2]，但不當(dāng)?shù)妮椪諘?huì)對(duì)食品的口味、營養(yǎng)等產(chǎn)生副作用，超出安全范圍的輻照劑量或輻照殘留也存在對(duì)人體健康的安全隱患[3]。因此，開展輻照食品的檢測(cè)技術(shù)研究，制定相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于我國消除發(fā)達(dá)國家技術(shù)貿(mào)易壁壘，仲裁國際農(nóng)產(chǎn)品安全問題爭(zhēng)端，加強(qiáng)我國輻照食品的標(biāo)識(shí)管理具有重要意義。

輻照食品檢測(cè)方法包括物理方法、化學(xué)方法和生物方法[4-5]，目前尚不存在某一種方法能夠判別所有的食品是否經(jīng)過輻照，也不能判定輻照食品吸收劑量的多少[6]。本研究采用的彗星電泳法（Comet assay），是一種快速、靈敏、廉價(jià)、可靠的DNA損傷鑒定方法，原則上適用于所有含DNA的輻照食物檢測(cè)，其原理為：食品經(jīng)輻照處理后，DNA分子斷裂，產(chǎn)生大量碎片。裂解細(xì)胞膜、核膜，然后在一定電壓下電泳，DNA碎片由于帶負(fù)電荷，將向陽極遷移，從而形成“彗星”狀尾部。輻照過的細(xì)胞形成的彗尾更長、更寬，而未受輻照的細(xì)胞顯現(xiàn)出近環(huán)形或者僅僅只有一個(gè)很小的“尾巴”。通過觀察“彗星”現(xiàn)象可對(duì)樣品是否經(jīng)過輻照做出判斷；通過測(cè)量“彗星”產(chǎn)生的長度、密度等參數(shù)可進(jìn)一步對(duì)輻照劑量進(jìn)行分析[7]。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗(yàn)材料

市購試驗(yàn)材料12種：馬鈴薯、小麥、黃豆、杏仁、杏脯、冷凍雞肉、新鮮雞肉、熟制雞肉、冷凍鱈魚片、冰鮮魚片、花椒、桂皮。

2.1.2 試劑

正常熔點(diǎn)瓊脂糖NMA：西班牙BIOWEST公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖LMA：美國SeaPlaque公司；溴化乙錠EB：Sigma公司；肌氨酸鈉、Triton X-100、DMSO及其他試劑：國產(chǎn)，分析純。

2.1.3 主要儀器

水平電泳儀：美國BIO-RAD SC；熒光顯微鏡：Nikon 80i。

2.2 方法

2.2.1 樣品處理

將12種市購試驗(yàn)材料分裝、標(biāo)記，在核工業(yè)大連應(yīng)用技術(shù)研究所輻照中心以60Co-γ射線進(jìn)行輻照處理，輻照劑量分別為1KGy、3KGy、5KGy、7KGy和10KGy。

根據(jù)上述不同輻照劑量設(shè)5個(gè)試驗(yàn)組，以不經(jīng)過輻照處理但其他制備條件相同的樣品為對(duì)照組，每組兩個(gè)平行。彗星電泳方法參考?xì)W盟標(biāo)準(zhǔn)BS EN 13784:2002[8]和國標(biāo)GB/T 23748-2009[9]，優(yōu)化后采用。

2.2.2 單細(xì)胞懸液的制備

將樣品去皮、去殼碾碎或去脂，切成小薄片或剪碎至云霧狀，稱取1g加入10mL預(yù)冷的PBS，磁力攪拌器500次/min攪拌5min，200目篩網(wǎng)過濾，濾液2000rpm離心10min，棄上清，用1mL預(yù)冷的PBS重懸，渦旋混勻，冰浴5min。調(diào)整細(xì)胞濃度為104-105/mL。

2.2.3 膠片制備

雙層鋪膠法：第一層滴加0.7 5%NMA100μL，迅速蓋上蓋玻片，4℃固化10min；第二層為75μL 0.75% LMA與25μL單細(xì)胞懸液混合液，迅速蓋上蓋玻片，4℃固化10min。

2.2.4 裂解、電泳

立即移去蓋玻片浸入預(yù)冷的新鮮裂解液中，暗室、低溫下裂解1.5-2h；裂解后用PBS洗2次，預(yù)冷的新鮮電泳液（5×TBE）沒過膠面0.2-0.3cm，靜置20min解旋；調(diào)節(jié)電壓20V、電流200mA，電泳20min，暗室進(jìn)行。

裂解液配制：NaCl 2mol/L、Na2EDTA 30mmol/L、Tris-HCl 10 mmol/L、肌氨酸鈉1%，pH值8.4，現(xiàn)用現(xiàn)配；用0.22μm的濾膜過濾除菌，用前加入新鮮配制的1%的Triton X-100和10%的DMSO。

2.2.5 染色觀察及結(jié)果分析

EB染色1min，水洗后立即觀察，激發(fā)光為515nm-560nm的綠光，發(fā)照波長為590nm。每個(gè)樣品隨機(jī)觀測(cè)100個(gè)細(xì)胞。

圖像采用CASP軟件進(jìn)行彗星分析，SPSS軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，以尾長（TL）、尾部DNA含量（TDNA%）、尾矩（TM）、Olive尾矩（OTM）作為指標(biāo)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.2.6 彗星電泳的檢測(cè)時(shí)效性研究

經(jīng)上述劑量輻照的小麥樣品，分別在輻照后1d、2d、3d、5d時(shí)，進(jìn)行彗星電泳，隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，以O(shè)TM為指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?？紤]到輻照中心在外地的實(shí)際情況，以照后6h為對(duì)照組。

3 結(jié)果

3.1 輻照食品的顯微觀察

經(jīng)過輻照處理的樣品觀察到明顯的拖尾現(xiàn)象，未經(jīng)輻照處理的樣品為圓形或近圓形（如圖1），檢測(cè)靈敏度達(dá)到1KGy輻照劑量。但未經(jīng)輻照處理的熟制雞肉樣品也觀察到彗星拖尾現(xiàn)象。

圖1 馬鈴薯EB染色彗星圖像

3.2 彗星圖像分析

以馬鈴薯樣品為例，染色后以CASP軟件抓圖，能夠清楚的區(qū)分頭部和尾部。分析數(shù)據(jù)用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖2。

圖2 馬鈴薯經(jīng)不同輻照劑量處理的變化

圖2顯示，隨著輻照劑量的增加，馬鈴薯樣品TL、TDNA%、TM、OTM指標(biāo)均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，各輻照劑量組與對(duì)照組相比均具有極顯著差異（P<0.01），且隨著劑量的增加差異愈加顯著，具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。但隨著輻照劑量的增加，TL、TDNA%指標(biāo)開始出現(xiàn)平臺(tái)期趨勢(shì)，而復(fù)合指標(biāo)TM、OTM仍呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。這說明矩類復(fù)合指標(biāo)能夠更準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞DNA損傷。

3.3 DNA損傷的劑量-效應(yīng)關(guān)系

以O(shè)TM指標(biāo)對(duì)5個(gè)試驗(yàn)組和對(duì)照組樣品彗星電泳數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，繪制12種樣品的劑量-效應(yīng)擬合曲線（圖3）以及回歸曲線（表1）。結(jié)果顯示，除熟制雞肉外，其余11種樣品隨輻照劑量的不斷增加，其OTM值呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，表明細(xì)胞DNA損傷呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性增加。而熟制雞肉在輻照劑量為0Kgy時(shí)即有彗星圖像出現(xiàn)，且隨輻照劑量增加，其DNA損傷無明顯增加或減弱，表明其DNA損傷與輻照無關(guān)，也沒有劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖3 12種樣品的劑量-效應(yīng)擬合曲線

表1 12種樣品的回歸曲線列表

（續(xù)表）

3.4 彗星電泳檢測(cè)時(shí)效性研究

表2分析了小麥樣品經(jīng)60Co-γ射線照射后不同時(shí)相點(diǎn)殘存DNA損傷的彗星電泳OTM，以照后6h為對(duì)照組，結(jié)果表明，照后1d可見DNA發(fā)生修復(fù)，隨照后時(shí)間的推移，DNA損傷的修復(fù)增加，殘余損傷逐漸減少，但至照后5d，彗星電泳OTM指標(biāo)與對(duì)照組相比較仍存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。

表2 不同劑量小麥輻照后不同時(shí)間點(diǎn)彗星電泳的OTM（x±s）

4 討論

（1）由于彗星電泳方法是通過破裂樣品細(xì)胞膜和核膜，使輻照產(chǎn)生的DNA斷裂碎片遷出細(xì)胞核，從而檢測(cè)DNA損傷判斷輻照狀況。而熟制食品通常細(xì)胞中膜結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞，DNA已有斷裂碎片產(chǎn)生，無論是否經(jīng)過輻照都可能產(chǎn)生彗星圖像，據(jù)此無法判斷輻照狀況。因此，原則上彗星電泳實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)所有含DNA的食品，但加工工藝已造成DNA損傷的食品除外。

（2）彗星電泳技術(shù)有中性彗星電泳和堿性彗星電泳兩種，一般認(rèn)為，中性彗星電泳檢測(cè)的是DNA雙鏈斷裂，而堿性彗星電泳能夠檢測(cè)DNA單鏈斷裂和堿性單位點(diǎn)變異[10]。雖然堿性彗星電泳檢測(cè)靈敏度更高，但由于DNA斷裂可能由輻照以外的因素如毒素、藥物甚至環(huán)境等引起，因此其檢測(cè)輻照的假陽性率較高，并且據(jù)報(bào)道，其時(shí)效性也較差[11]，因?yàn)镈NA損傷的修復(fù)作用使得檢測(cè)到的DNA單鏈斷裂迅速減少。而輻照引起的多為DNA雙鏈斷裂，因此中性彗星電泳更適合于檢測(cè)輻照引起的DNA損傷，更重要的是，本研究的檢測(cè)時(shí)效性結(jié)果證實(shí)輻照6h-5d后仍可檢測(cè)到明顯的彗星圖像。下一步對(duì)檢測(cè)時(shí)效性的研究應(yīng)進(jìn)一步深入并延長檢測(cè)時(shí)間。

（3）本研究選用長度指標(biāo)TL、強(qiáng)度指標(biāo)TDNA%和矩類指標(biāo)TM、OTM進(jìn)行電泳結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)TL、TDNA%在較大劑量時(shí)出現(xiàn)曲線平臺(tái)，TM、OTM則無，與報(bào)道一致。原因是在一定輻照劑量范圍內(nèi)，隨劑量的增大，DNA雙鏈斷裂點(diǎn)增多，片段變小，因而TL增大，TDNA%含量增多；一旦超過此劑量范圍，即使劑量增大，DNA片段不再減小，只是表現(xiàn)為斷裂碎片增多，那么電泳后TL和彗星全長不再增加，TDNA%也不再增多，因而長度和強(qiáng)度指標(biāo)的劑量-效應(yīng)曲線出現(xiàn)平臺(tái)。而矩類指標(biāo)由于是復(fù)合指標(biāo)，反應(yīng)的是彗星圖像的綜合特征，即使劑量較大時(shí)也不會(huì)出現(xiàn)平臺(tái)，符合輻射生物劑量學(xué)指標(biāo)應(yīng)具備的條件，是目前公認(rèn)的比較準(zhǔn)確的指標(biāo)[12]，能夠滿足多種情況下的彗星電泳結(jié)果分析，因此，推薦采用矩類指標(biāo)進(jìn)行彗星圖像的分析。

（4）本研究用免費(fèi)的CASP軟件自動(dòng)分析彗星圖像，軟件容易獲得，結(jié)果客觀可靠，避免了人為誤差。

5 結(jié)論

彗星電泳技術(shù)能夠在輻照后6h-5d檢測(cè)到除熟制食品外的樣品輻照狀況，僅需1g樣品即可開展試驗(yàn)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到1KGy輻照劑量。檢測(cè)的DNA損傷具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，以TM和OTM等矩類指標(biāo)分析不存在平臺(tái)期，可獲得客觀準(zhǔn)確的結(jié)果。

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