蘇建暉 蔡 穎 許如蘇 周廣彪 曾梅錦

（汕頭出入境檢驗檢疫局 廣東汕頭 515031）

1 前言

綠膿桿菌也稱銅綠假單胞菌，在自然界分布廣泛，空氣、水、土壤中均有存在，易引起人皮膚化膿感染，特別是燒傷、燙傷、眼部疾病患者被感染后，常使病情惡化，并可引起敗血癥。因此，日本、歐盟、中國、美國等各國和地區(qū)均把它定為化妝品中的重要檢測指標，規(guī)定在化妝品中不得檢出。

在現(xiàn)行國家標準[1]中，化妝品中綠膿桿菌的檢驗采用傳統(tǒng)方法，即選擇性增菌、平板分離培養(yǎng)、顯微鏡檢與生化鑒定。由于這種方法所需周期較長，工作量大，消耗試劑多，操作者需要有較豐富的實踐經(jīng)驗，并且靈敏度較低，因此，已不能滿足現(xiàn)代快、準、靈的要求。

PCR技術(shù)在微生物檢測中已有很多研究報道[2-5]，也被其他許多國家標準或行業(yè)標準采用[6-8]，本項目對以oprI為靶基因?qū)崟r熒光PCR法檢測化妝品中的綠膿桿菌進行了研究，包括增菌液中DNA的提取方法、引物探針的設(shè)計及篩選、PCR反應條件及參數(shù)的優(yōu)化、特異性及標準曲線的建立以及靈敏度、重復性、穩(wěn)定性試驗等，以期建立更快、更好、更節(jié)約的新檢測方法或初篩方法，應用于化妝品生產(chǎn)企業(yè)對原材料、半成品、成品的質(zhì)量控制把關(guān)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗樣品

粉餅、沐浴露、發(fā)油、睫毛膏、洗發(fā)香波、護發(fā)素、發(fā)膠、唇彩、眼影、指甲油、口紅、啫喱密、面霜、香水：來源于汕頭櫻姬化妝品廠、汕頭市深特寶潔實業(yè)有限公司、汕頭市奇?zhèn)崢I(yè)有限公司、汕頭市金奇日化有限公司、汕頭市艾迪絲化妝品有限公司、廣東拉芳日化有限公司等單位。

2.1.2 儀器

Lightcycler480熒光定量PCR儀：瑞士Roche；低溫高速離心機：12000r/min以上，德國貝克曼公司；生物安全柜：美國FORMA；電子天平：精度至0.01g，梅特勒公司；恒溫生化培養(yǎng)箱：上海一恒；FTA卡：美國Whatman公司；打孔機：美國Whatman公司；脈沖均質(zhì)器：英國PUL100E。

2.1.3 試劑

Takara 2×PCR反應液：包括Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、TE液，寶生物工程大連有限公司；TE緩沖液：購自寶生物工程大連有限公司；超純水：Milli-Q純水器制得；SCDLP液體培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)有限公司。

2.1.4 試驗菌株

15株冷凍干粉標準菌種：購自中國普通微生物菌株保藏中心（CGMCC）、 工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）、中國醫(yī)學細菌保藏管理中心（CMCC ）、美國菌種保藏中心（ATCC）、廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心（GIM）；21株陽性工作菌株：來自CNAS能力驗證、本單位實驗室、汕頭市食品藥品監(jiān)督管理局、汕頭市金奇日化有限公司、汕頭市奇?zhèn)崢I(yè)有限公司、汕頭市中心醫(yī)院等單位；51株陰性菌株：來自中國菌種保藏中心、廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心等單位。詳見表1、表2、表3。

表2 試驗陽性菌株的來源

表3 試驗陰性菌株的來源

2.2 方法

2.2.1 引物和探針的設(shè)計與合成

從GenBank中找到綠膿桿菌有高度保守性的編碼外膜蛋白(oprI)基因，并以此為目的基因設(shè)計引物、探針。引物和探針由大連寶生物技術(shù)有限公司合成。

使用時，引物探針從冷凍冰箱取出后先回溫，需彈擊振勻，離心聚集后使用效果較佳。

2.2.2 樣品制備

參照化妝品衛(wèi)生規(guī)范（2007版）[1]，取樣品10mL（g），其中水溶性樣品加到90mL滅菌生理鹽水中，疏水性樣品加5mL石蠟、10mL吐溫80、75mL滅菌生理鹽水，脈沖均質(zhì)器均質(zhì)15s，制成取1:10樣品稀釋液。

2.2.3 增菌培養(yǎng)

取1:10樣品稀釋液10mL加到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6h。如有綠膿桿菌生長，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍綠色，表面多有一層薄菌膜。

2.2.4 模板DNA提取

取1mL樣品增菌液于1.5mL離心管中，14000r/min離心3min，棄去上清液；加TE緩沖液洗滌沉淀1次，重復離心，棄去上清液；沉淀加100μL去離子水懸浮，于沸水浴中煮沸10min，冰浴5min，14000r/min離心3min，取上清液為模板。提取DNA時，由于1.5mL離心管存在內(nèi)外氣壓差，偶爾會出現(xiàn)沖蓋現(xiàn)象，因此在檢樣在上機擴增前最好先在干熱孵育器上以90℃預熱后，蓋緊，加貼封口膜，這樣能防止溢出。

取1mL樣品增菌液于1.5mL離心管中，14000r/min離心3min，棄去上清液，加TE緩沖液洗滌沉淀1次，重復離心，棄去上清液，沉淀加100μL去離子水懸浮，于沸水浴中煮沸10min，冰浴5min，14000r/min離心3min，取上清液為模板。

2.2.5 實時熒光PCR試驗

反應總體積為20μL，其中Takara 2×PCR反應液10μL，20μmol/L上下游引物混合液1.0μL，20μmol/L探針0.1μL，模板2.0μL，超純水8.9μL。反應參數(shù)為：95℃ 50s，95℃ 5s，60℃ 40s（檢測熒光信號），40個循環(huán)。

熒光信號采集波長：Hex(523nm-568nm)。

2.2.6 結(jié)果判定

反應結(jié)束后，取出PCR反應板。常規(guī)按照默認的二階求導法計算CP值數(shù)值，查看樣品、陽性和陰性對照擴增情況。陽性對照CP值＜30，陰性對照無CP值，實驗成立，可進行實驗樣品的結(jié)果判定：CP值＜35為試驗陽性；檢測不到CP值為試驗陰性；如CP值≥35，且擴增曲線明顯呈對數(shù)增長，判為可疑，應延長增菌培養(yǎng)時間至少2h，甚至培養(yǎng)過夜后重新試驗，若CP值明顯變小，則判為陽性，否則判為陰性。

3 結(jié)果與分析

3.1 引物和探針序列

引物和探針的序列見表4。

表4 引物和探針的序列

3.2 DNA提取方法

3.2.1 不同方法比較

本研究采用了兩種D N A提取方法進行比較。方法1：參照許如蘇[5]沸騰方法（見2.2.3、2.2.4），將上清液轉(zhuǎn)移至新管備用（不能及時檢驗，則放置于-20 ℃保存）。每20μL PCR反應體系中加入2μL模板。方法2：化妝品樣品經(jīng)SCDLP培養(yǎng)后，滴加200μL增菌液于FTA卡片圓圈中，風干1h后備用，以直徑0.5mm打孔器在FTA卡片上取1孔加入20μL PCR反應體系中。

15株標準菌株、21株參考菌株、51株非綠膿桿菌菌株的檢測結(jié)果顯示兩種方法在特異性方面沒有明顯區(qū)別，均為100%。但卡片法在靈敏度上比沸騰法低一個量級，因為在滴加入SCDLP增菌液時，是以若干個點為中心進行擴散，菌濃度在卡片上的分布不甚均勻，故在低濃度時效果欠佳，不易檢出，而且FAT卡片法成本相對高，所以本研究采用沸騰法。靈敏度試驗結(jié)果詳見表6。

3.2.2 洗滌步驟比較

對沸騰法提取DNA是否一定要經(jīng)過兩次洗滌離心步驟進行了比較。比較對象為添加大約2000CFU/mL綠膿桿菌的各種化妝品SCDLP培養(yǎng)基，分經(jīng)洗滌與不經(jīng)洗滌進行測定，其余步驟均相同。

結(jié)果顯示，不經(jīng)洗滌的樣品，除發(fā)膠外，其余如潤膚露、洗發(fā)水、淋浴露、粉餅、眼影等一般化妝品，提取效果良好，說明可不經(jīng)離心洗滌，直接沸騰10min，冰冷后離心取上清液測定。采用這種方式具有：①減少污染環(huán)境，更加符合生物安全操作；②實驗證明由于減少了洗滌步驟，從而可以減少DNA損失；③減少操作步驟，能提高工作效率。但未經(jīng)洗滌，個別樣品的擴增曲線較平，波形欠佳。此外，發(fā)膠可能含有抑制熒光的物質(zhì)，故檢測不出綠膿桿菌。而經(jīng)過洗滌的測試樣品均可檢出綠膿桿菌，但CP值稍大些。具體結(jié)果見表5。

表5 樣品前處理經(jīng)TE液洗滌效果比較

綜合考慮，所有化妝品統(tǒng)一采用經(jīng)過洗滌的步驟，雖然降低一點靈敏度，但在準確度與擴增曲線線形上能取得較好效果。

3.3 儀器條件的優(yōu)化

反應退火溫度為60℃時，靈敏度較高，但一些非綠膿桿菌的假單胞菌，如惡臭假單胞菌、親水假單胞菌、洋蔥假單胞菌等的CP值在33-35之間，易造成可疑性干擾；而退火溫度為59℃時，既有較高的靈敏度，非綠膿桿菌的假單胞菌CP值均>35，不會干擾目標菌檢測。

儀器檢測器采用523-568nm（Hex）通道采集熒光信號。

3.4 特異性試驗

以表1-表3的87株標準和參考菌株提取的DNA為模板，對綠膿桿菌進行實時熒光PCR試驗，同時檢測10份污染大量雜菌（無綠膿桿菌）的樣品，以驗證本方法對綠膿桿菌和自然界其他微生物的特異性。

試驗結(jié)果顯示，只有相對應的菌株出現(xiàn)陽性反應，其他非對應菌株和污染雜菌的樣品全部均為陰性反應，說明針對綠膿桿菌建立的實時熒光PCR方法具有高度特異性。

陰性反應中的惡臭假單胞菌、洋蔥假單胞菌、親水假單胞菌等均有擴增，但CP值處于≥35、<40之間，延長增菌培養(yǎng)時間至16h后重新試驗，CP值無明顯變小，仍處于≥35、<40之間;陰性反應中金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、黑曲霉、白色念珠球菌等檢測不到CP值。陽性反應的CP值均＜30；當綠膿桿菌菌濃度＜1CFU/反應體系時，CP值有時會處于≥35、<40之間，但延長增菌培養(yǎng)時間至16h后重新試驗，CP值明顯變小至＜30。

3.5 靈敏度試驗

綠膿桿菌標準菌株經(jīng)營養(yǎng)肉湯復壯、十六烷甲基溴化銨培養(yǎng)基分純培養(yǎng)后，劃血平板，以接種環(huán)挑取新鮮菌苔若干環(huán)配成一定麥氏度的菌懸液；取1.0mL該菌液加入90mLSCDLP液中，再添加1.0g模擬潤膚露作化妝品本底后，振蕩均勻；將該SCDLP液依次進行10倍稀釋，配成10-1-10-9濃度的系列標準菌株稀釋樣液；各取1.0mL該系列標準菌株稀釋樣液，以營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)，計數(shù)菌含量，同時按化妝品中實時熒光PCR方法對該系列標準菌株稀釋樣液提取DNA后測定綠膿桿菌，結(jié)果見表6。

表6 靈敏度試驗結(jié)果

結(jié)果顯示，沸騰法實時熒光PCR試驗的靈敏度均能達到低于2CFU/反應體系，非常靈敏。

3.6 線性關(guān)系

按照與3.5同樣的步驟進行試驗，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 引物1綠膿桿菌靈敏度擴增曲線

圖2 引物1綠膿桿菌標準曲線

結(jié)果顯示，當綠膿桿菌濃度處于103-107CFU/mL，初始菌濃度對數(shù)值與CP值呈良好的線性關(guān)系。

3.7 重復性試驗

配制含綠膿桿菌高、中、低不同菌濃度的模擬潤膚露SCDLP培養(yǎng)液，每個濃度各測定5次，計算變異系數(shù)，結(jié)果見表7、圖3。

表7 重復性試驗結(jié)果

圖3 重復試驗擴增曲線

結(jié)果顯示，其批內(nèi)CP值的變異系數(shù)小于2%?？梢娫搶崟r熒光PCR方法具有良好的可重復性，滿足實驗統(tǒng)計學要求。

3.8 熒光PCR試劑的穩(wěn)定性檢測結(jié)果

試劑組成如下：TE緩沖液、Takara 2×PCR反應液、引物探針反應液1套、陽性對照模板、陰性對照模板、去離子水。

穩(wěn)定性檢測已進行12次，延續(xù)12個月，檢測結(jié)果仍保持穩(wěn)定。因此，試劑組成的有效期至少12個月。

3.9 與GB方法的比較

綠膿桿菌實時熒光PCR方法與GB標準傳統(tǒng)方法比較，方法特異性吻合率達100%，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

當染菌量>50CFU/g時，實時熒光PCR方法的檢測結(jié)果與GB標準傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果一致，但檢測速度快10倍以上；當染菌量<50CFU/g時，兩者的檢測結(jié)果出現(xiàn)波動，即有的樣品為陽性，有的樣品為陰性，且不完全一致，但實時熒光PCR方法的檢出率較GB標準傳統(tǒng)方法稍高，原因是實時熒光PCR方法的提取DNA后有一個濃縮10倍的操作，如果進一步縮小定容體積，擴大濃縮倍數(shù)，也可以再提高檢出限附近的陽性率。

4 結(jié)論

（1）以oprI為靶基因的實時熒光PCR檢測化妝品中綠膿桿菌的方法，具有準確、靈敏、快速、操作簡便與高通量檢測等特點，可在食藥局、技監(jiān)局、檢驗檢疫局、化妝品企業(yè)中推廣應用。

（2）由于化妝品中綠膿桿菌檢測尚無有關(guān)PCR技術(shù)的標準方法，因此建議將此方法上升為標準方法。

（3）據(jù)查ATCC綠膿桿菌標準菌株有近300株，由于資金不足等條件限制，本研究只對現(xiàn)有的15株標準菌株與21株陽性工作菌株進行了試驗，效果均滿意，但未能進行更多試驗，因此普遍性適用研究還有待更深入的驗證。

［1］化妝品衛(wèi)生規(guī)范（2007版）[S].

［2］劉芳. 環(huán)介導等溫擴增快速檢測銅綠假單胞菌的研究[J]. 檢驗檢疫學刊，2013，4：4-6.

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