盧燕，盧華杰，劉焱文

(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 中藥資源與中藥化學(xué)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430061)

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2010BAE00386)

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劉焱文，Tel：(027)88920834；E-mail：ywliu2008@163.com

茯苓酸性多糖分級(jí)提取及其抗腫瘤活性比較△

盧燕，盧華杰，劉焱文*

(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 中藥資源與中藥化學(xué)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430061)

目的以不同堿度分級(jí)提取茯苓酸性多糖，進(jìn)行抗腫瘤活性比較研究，以期探討茯苓酸性多糖的構(gòu)效關(guān)系。方法將茯苓飲片分別用70%乙醇和水提取后的藥渣，依次用0.1～1.0 mol·L-110個(gè)梯度氫氧化鈉(NaOH)溶液分級(jí)提取，得到10種茯苓酸性多糖組分提取物；采用MTT法測(cè)定對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞抑制率，比較10種分級(jí)酸性多糖體外抗腫瘤活性大小。結(jié)果0.9和1.0 mol·L-1NaOH提取的茯苓酸性多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率最高。結(jié)論茯苓酸性多糖抗腫瘤活性與其酸性強(qiáng)弱相關(guān)。

茯苓；酸性多糖；分級(jí)分離；抗腫瘤活性

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的干燥菌核，是藥食兩用的傳統(tǒng)中藥大品種，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為“上品”[1]；收載于歷版《中國(guó)藥典》一部，具有利水滲濕、健脾、寧心的功能。茯苓多糖是茯苓的主要成分，其含量可達(dá)茯苓干重的80%以上?，F(xiàn)代藥理研究表明，茯苓多糖經(jīng)降解和結(jié)構(gòu)修飾后具有抗腫瘤作用。談新提等[2]將茯苓多糖羧甲基化、硫酸酯化產(chǎn)物進(jìn)行抗腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)研究，顯示良好的抗腫瘤生物活性。趙吉福等[3]對(duì)磺?；蜍叨嗵沁M(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤作用研究，其抗腫瘤活性明顯。但是，迄今尚未見國(guó)內(nèi)外有關(guān)茯苓酸性多糖直接用于抗腫瘤作用的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)茯苓多糖進(jìn)行了系統(tǒng)研究，表明茯苓多糖以酸性多糖為主，為總多糖含量的90%以上，其動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)具有顯著性藥理作用[4]。為了探討不同酸度茯苓多糖抗腫瘤生物活性，筆者采用0.1～1.0 mol·L-1梯度濃度氫氧化鈉(NaOH)溶液分級(jí)提取茯苓酸性多糖，依次提取分離到10種酸性多糖組分，并進(jìn)行了抗腫瘤活性的比較研究，以期為進(jìn)一步探討茯苓多糖構(gòu)效關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

JJ-1增力電動(dòng)攪拌器(金壇市宏華儀器廠)，F(xiàn)D-1A-50冷凍干燥儀(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，F(xiàn)orma series IICO2Water Jacketed恒溫培養(yǎng)箱(Thermo electron)，Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(Thermo electron)，AL204型萬分之一分析天平(瑞士Metter Toledo公司)。

1.2 藥物與試劑

茯苓購自湖北羅田九資河，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室張秀橋老師鑒定為正品。HepG2人肝癌細(xì)胞(武漢大學(xué)余建清教授提供)、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素購自HyClone公司，胎牛血清購自GIBCO公司，二甲基亞砜(DMSO)、MTT粉末購自AMRESCO公司，水為自來水，氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)等試劑均為分析純。

1.3 供試溶液的制備

1.3.1 分級(jí)茯苓酸性多糖的提取分離 稱取茯苓塊100 g，用70%的乙醇和水回流提取后的藥渣，用70倍量0.1 mol·L-1NaOH溶液室溫?cái)嚢杼崛? h，500目濾布過濾，濾液用20% HCl中和，得到茯苓酸性多糖組分混懸液；其濾渣依次用0.2～1.0 mol·L-1梯度NaOH溶液分級(jí)提取分離，得到9個(gè)茯苓酸性多糖組分混懸液，分別將10種分級(jí)茯苓酸性多糖混懸液通過分子截留量為3 500的透析袋透析，直至透析液用硝酸銀檢測(cè)為陰性；將除鹽后的分級(jí)多糖冷凍干燥，即得到10種分級(jí)茯苓酸性多糖干燥品，制備結(jié)果見表1。

表1 分級(jí)多糖編號(hào)及收率

1.3.2 分級(jí)茯苓酸性多糖供試溶液制備 精密稱定不同多糖樣品，將樣品溶于DMSO，用培養(yǎng)基稀釋成終濃度為100 μg·mL-1，備用。

2 方法

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與鋪板

將處于對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度，為1×106個(gè)·mL-1，于96孔板中每孔加入100 μL的細(xì)胞懸液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底。

2.2 給藥

取出96孔板，吸棄原來的培養(yǎng)基，每孔加入100 μL藥液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.3 染色

藥物作用24 h后，向每孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。

2.4 測(cè)定

MTT作用完成后，吸去培養(yǎng)基和MTT，每孔中加入100 μL DMSO溶液，避光、低速振蕩10～20 min，至紫色結(jié)晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的OD值，記錄并計(jì)算抑制率。

3 結(jié)果

分級(jí)酸性多糖對(duì)腫瘤抑制率見表2和圖1。由表2和圖1可知，茯苓酸性多糖分級(jí)提取分離的10個(gè)組分樣品均具有不同程度的抑制腫瘤細(xì)胞的生物活性，其中PAP9和PAP10對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯高于其他各組分多糖。

表2 分級(jí)多糖樣品腫瘤抑制率

注：(1)各級(jí)多糖濃度為100 μg·mL-1；(2)與PAP1比較，*P<0.05，**P<0.01

圖1 分級(jí)酸性多糖對(duì)腫瘤抑制率的比較

4 討論

茯苓的主要物質(zhì)成分為多糖，其含量達(dá)80%以上，國(guó)內(nèi)外諸多文獻(xiàn)報(bào)道，茯苓羧甲基多糖具有抗腫瘤生物活性。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，茯苓多糖以酸性多糖為主，占總多糖含量的90%以上；將茯苓酸性多糖直接進(jìn)行了抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能及阿霉素致腎病模型的藥效學(xué)研究，均具有顯著的藥理效果。

為了探討茯苓酸性多糖的生物活性與其酸性強(qiáng)弱和分子量大小的相關(guān)性，筆者采用0.1～1.0 mol·L-1梯度NaOH溶液將茯苓酸多糖分級(jí)分離為10個(gè)組分，進(jìn)行抗腫瘤生物活性比較研究。研究結(jié)果表明，各分級(jí)組分茯苓酸性多糖均有不同程度抗腫瘤活性，但0.9，1.0 mol·L-1NaOH溶液分級(jí)分離得酸性多糖抗腫瘤活性明顯高于其他分級(jí)組分酸性多糖。說明茯苓酸性多糖抗腫瘤活性與其酸性強(qiáng)弱密切相關(guān)，弱酸性多糖抗腫瘤活性優(yōu)于強(qiáng)酸性多糖，從而為進(jìn)一步探討茯苓酸性多糖的構(gòu)效關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

茯苓酸性多糖構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究，擬在本文研究基礎(chǔ)上，對(duì)茯苓酸性多糖分級(jí)分離10個(gè)組分多糖的分子量、單糖組成及其連接方式等進(jìn)行系統(tǒng)研究。以期闡明茯苓酸性多糖的構(gòu)效關(guān)系，從而為茯苓多糖的深度開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

[1] 鄭威，茯苓多糖及其修飾物抗腫瘤作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J].健康研究，2011，31(5)：379-381.

[2] 談新提，王藝峰，張麗娜，等.化學(xué)修飾的茯苓多糖抗腫瘤效應(yīng)的組織學(xué)觀察[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2004，25(6)：652-683.

[3] 趙吉福，么雅娟，陳英杰，等.磺?；萝蜍叨嗵堑闹苽浼翱鼓[瘤作用[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，67(2)：125-138.

[4] 鄧媛媛，邵貝貝，王光忠，等.茯苓調(diào)節(jié)免疫功能有效物質(zhì)的比較研究[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2012，12(10)：94-95.

[5] 張文女，黃金龍.茯苓多糖的抗腫瘤作用[J].中草藥，1990，30(7)：38-39.

PoriaAcidicPolysaccharidesExtractGradingandItsAntitumorActivity

LUYan，LUHuajie，LIUYanwen*

(HubeiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Wuhan430061，China)

Objective：To extract different grading Poria acidic polysaccharides，analyzed its anti-tumor activity in order to investigate the Poria acidic polysaccharides structures-efficacy relationship.MethodsPoria pieces were extracted residue by water and 70% ethanol，washed with 0.1-1.0 mol·L-1NaOH solution of gradient extraction procedure，get 10 Poria extract acidic polysaccharides，using the MTT assay of HepG2 tumor cells inhibition rate compared 10 kinds of grading acidic polysaccharides antitumor activity in vitrosize.Results0.9 and 1.0 mol·L-1NaOH acidic polysaccharides extracted from Poria had highest inhibition rate to tumor cells.ConclusionPoria antitumor activity of acidic polysaccharides associated with their acidities.

Poria；Acidic polysaccharides；Fractionation；Antitumor activity

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.02.004

2013-07-12)