丁 爽， 李青峰， 李廣帥， 鄭 巖， 于冬梅， 羅 賽， 郝立君

實(shí)驗(yàn)研究

神經(jīng)再生條件液對(duì)成纖維細(xì)胞和施旺細(xì)胞的生物學(xué)活性影響

丁 爽， 李青峰， 李廣帥， 鄭 巖， 于冬梅， 羅 賽， 郝立君

目的探索神經(jīng)再生條件液對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠成纖維細(xì)胞和施旺細(xì)胞的生物學(xué)活性影響。方法用含有不同濃度的NRCF的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)成纖維細(xì)胞和施旺細(xì)胞24 h,用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,免疫熒光法檢測(cè)施旺細(xì)胞去分化。結(jié)果隨著神經(jīng)再生條件液濃度的提高及神經(jīng)再生條件液對(duì)細(xì)胞作用時(shí)間的增加，成纖維細(xì)胞和施旺細(xì)胞的增殖呈上升趨勢(shì); 神經(jīng)再生條件液對(duì)成纖維細(xì)胞和施旺細(xì)胞的細(xì)胞周期改變發(fā)生在S期；神經(jīng)再生條件液能夠促進(jìn)施旺細(xì)胞去分化。結(jié)論神經(jīng)再生條件液能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖并促進(jìn)施旺細(xì)胞的增殖和去分化。

外周神經(jīng)損傷； 神經(jīng)再生條件液； 成纖維細(xì)胞； 施旺細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 去分化

周?chē)窠?jīng)損傷時(shí)，在損傷的神經(jīng)遠(yuǎn)、近兩斷端間橋接一個(gè)硅膠管，形成一個(gè)密閉間隔，這個(gè)密閉的間隔被稱之為神經(jīng)再生室。神經(jīng)再生室模型所提供的封閉環(huán)境是研究周?chē)窠?jīng)再生的重要模型。神經(jīng)再生室內(nèi)所形成的再生微環(huán)境及其中的主要成分被稱為神經(jīng)再生條件液(nerve regeneration conditioned fluid, NRCF )[1]。研究顯示，NRCF非常適合對(duì)源于創(chuàng)傷神經(jīng)干斷端的活性因子的研究[1]。成纖維細(xì)胞和施旺細(xì)胞被證實(shí)大量存在于周?chē)窠?jīng)當(dāng)中[2]，自2012年3月，我們的實(shí)驗(yàn)著重研究NRCF對(duì)這兩種細(xì)胞的生物學(xué)活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Lewis雄性大鼠(華東師范大學(xué)SPF動(dòng)物中心提供)；新生Lewis大鼠1～3 d(上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院SPF動(dòng)物房提供)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)THERMO公司)；PBS、膠原酶(Collagenase NB4，德國(guó)SERVA公司);中性蛋白酶(dispaseⅡ，美國(guó)SIGMA公司); Anti-p75 NGF Receptor antibody(英國(guó)ABCAM公司)。

1.2 神經(jīng)再生室模型的建立及NRCF的提取 采用雄性Lewis大鼠50只，體質(zhì)量約150 g。將大鼠麻醉后，顯露坐骨神經(jīng),于坐骨切跡下10.0 mm處剪斷神經(jīng)并去除2.0 mm，用消毒后內(nèi)徑1.5 mm、長(zhǎng)14.0 mm硅膠管橋接兩斷端，形成神經(jīng)再生室模型。術(shù)后按標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)動(dòng)物，1周后，用微量注射器抽取再生室中的NRCF，每側(cè)神經(jīng)再生室獲取NRCF 3～5 μl，共獲取NRCF約200 μl。-80 ℃低溫凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 原代成纖維細(xì)胞和施旺細(xì)胞的提取及培養(yǎng)原代成纖維細(xì)胞和施旺細(xì)胞的提取。新生1～3 d的Lewis大鼠20只,取出坐骨神經(jīng),加入0.2%Collagenase NB4與0.2%dispase 1∶1混合液待充分消化后,放置5%CO2、37 ℃ 飽和濕度條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，用酶純化法純化施旺細(xì)胞。將純化后剩余的成纖維細(xì)胞和純化后的施旺細(xì)胞分別接種培養(yǎng)瓶中，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。

1.4 組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法 采用雄性Lewis大鼠20只，體質(zhì)量120 g左右。將大鼠麻醉后，截取出坐骨神經(jīng)。在顯微鏡下修剪成長(zhǎng)2.0～3.0 mm的小段，分別用DMEM培養(yǎng)基(對(duì)照組，A組)及含有NRCF濃度為1×104ng/ml的DMEM培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)組，B組)在5%CO2、37 ℃飽和濕度條件下恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。到達(dá)時(shí)間點(diǎn)后，提取培養(yǎng)的神經(jīng)置入含4%多聚甲醛的溶液中，4 ℃固定，備用。

1.5 CCK-8法 ①NRCF對(duì)成纖維細(xì)胞和施旺細(xì)胞的濃度梯度檢測(cè)。細(xì)胞倍增時(shí)間取培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)。按每孔1500 個(gè)細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分7組：1組作為對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)設(shè)為組1)；其余6組作為實(shí)驗(yàn)組(含有不同NRCF濃度的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng))分別設(shè)定NRCF濃度為：10、100、1×103、1×104、1×105、1×106ng/ml(依次設(shè)定為組2～7)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。接種后培養(yǎng)24 h用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值。②NRCF對(duì)成纖維細(xì)胞和施旺細(xì)胞的時(shí)間梯度檢測(cè)。細(xì)胞倍增時(shí)間取培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)。按每孔1500個(gè)細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分兩組：1組作為實(shí)驗(yàn)組(含有NRCF濃度為1×104ng/ml的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，設(shè)為組1)；2組作為對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，設(shè)為組2)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別以培養(yǎng)6、12、18、24 設(shè)為時(shí)間點(diǎn)。到達(dá)時(shí)間點(diǎn)后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 細(xì)胞倍增時(shí)間取培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)，接種于培養(yǎng)板中，分兩組：1組作為實(shí)驗(yàn)組(含有NRCF濃度為1×104ng/ml的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，設(shè)為組A)；2組為對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別設(shè)為組B、C、D、E)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。接種后分別培養(yǎng)6、12、18、24 h，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.7 免疫熒光 在顯微鏡下，將固定好的體外培養(yǎng)的神經(jīng)平鋪于載玻片上，標(biāo)本固定后，進(jìn)行免疫熒光染色。封片劑封片后,熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)則采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測(cè)增殖作用 ①成纖維細(xì)胞的增殖。通過(guò)CCK-8法檢測(cè)到成纖維細(xì)胞在含有不同濃度的NRCF培養(yǎng)基作用24 h后, 成纖維細(xì)胞的增殖隨著NRCF濃度的增加成上升趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)NRCF濃度設(shè)定為1×104ng/ml時(shí)，24 h內(nèi)隨著NRCF作用時(shí)間的延長(zhǎng),成纖維細(xì)胞的增殖呈遞增趨勢(shì)(圖1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。②施旺細(xì)胞的增殖。通過(guò)CCK-8法檢測(cè)到施旺細(xì)胞在含有不同濃度的NRCF的培養(yǎng)基作用24 h后,當(dāng)其濃度達(dá)1×104ng/ml以上時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；當(dāng)其濃度為1×104ng/ml時(shí)，24 h內(nèi)隨著NRCF作用時(shí)間的延長(zhǎng),施旺細(xì)胞的增殖呈遞增趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 ①成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。用含有1×104ng/ml濃度的NRCF培養(yǎng)基培養(yǎng)成纖維細(xì)胞,持續(xù)觀察24 h。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)的數(shù)據(jù)分析，成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期變化主要表現(xiàn)在S期(P<0.05)，S期的變化隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加成上升趨勢(shì)，18 h到達(dá)高峰(圖3)；②施旺細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。用含有1×104ng/ml濃度的NRCF培養(yǎng)基培養(yǎng)施旺細(xì)胞,持續(xù)觀察24 h時(shí)。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)的數(shù)據(jù)分析，施旺細(xì)胞的細(xì)胞周期變化主要表現(xiàn)在S期(P<0.05)。S期的變化隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)(圖4)。

2.3 免疫熒光法驗(yàn)證去分化 用含有1×104ng/ml濃度的NRCF培養(yǎng)基體外培養(yǎng)大鼠坐骨神經(jīng)，連續(xù)培養(yǎng)3 d，用施旺細(xì)胞特征性去分化抗體P75進(jìn)行免疫熒光染色(紅色)?？梢杂^察到實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有差異(圖5)，說(shuō)明NRCF能夠促進(jìn)施旺細(xì)胞去分化。

圖1 成纖維細(xì)胞的時(shí)間增殖曲線圖2 施旺細(xì)胞的時(shí)間增殖曲線(組1:實(shí)驗(yàn)組NRCF濃度為1×104ng/ml的DMEM培養(yǎng)基；組2:對(duì)照組DMEM培養(yǎng)基)

Fig1 Time-dependency proliferation curve of fibroblasts.Fig2 Time-dependency proliferation curve of Schwan cells(Group 1: the experimental group with DMEM including 1×104ng/ml NRCF. Group 2: the control group with DMEM).

3 討論

神經(jīng)再生具有自我完善和自我調(diào)控的能力(MA Bisby，1983年)。周?chē)窠?jīng)損傷后，能否實(shí)現(xiàn)成功再生，與神經(jīng)趨化性，損傷的局部對(duì)軸突的接觸引導(dǎo)作用，以及再生微環(huán)境等因素密切相關(guān)。近年來(lái)，隨著人們對(duì)分子生物學(xué)的深入研究，發(fā)現(xiàn)再生微環(huán)境是外周神經(jīng)損傷后能否實(shí)現(xiàn)成功再生的關(guān)鍵因素(朱家愷，1991年)。NRCF作為神經(jīng)再生室中的功能性成分,體現(xiàn)了周?chē)窠?jīng)再生微環(huán)境的特征[3]。NRCF能夠?qū)υ偕窠?jīng)提供營(yíng)養(yǎng)、支持和導(dǎo)向的作用，是神經(jīng)再生自我完善及自我調(diào)控機(jī)制充分發(fā)揮的重要條件[1]。較早的研究中，推測(cè)NRCF中可能主要存在三類物質(zhì)：神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophic factors, NTFs)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM )和促突起生長(zhǎng)因子(neuritepromoting factors, NPFs)[4]。李青峰等[5]通過(guò)Native PAGE分離NRCF中的蛋白成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為(232～440)×103的蛋白能促使后根神經(jīng)節(jié)突起的生長(zhǎng)，說(shuō)明NRCF具有明顯的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性和再生趨化性。

通過(guò)BCA法檢測(cè)，我們粗略地計(jì)算出提取出來(lái)的NRCF的蛋白濃度約為50 mg/ml。在本實(shí)驗(yàn)中可以觀察到，當(dāng)NRCF的濃度為1×103ng/ml時(shí)，就可以明顯地促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖作用，說(shuō)明NRCF中的蛋白成分對(duì)成纖維細(xì)胞具有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)中觀察到，隨著NRCF濃度的提高，成纖維細(xì)胞的增殖呈上升趨勢(shì)；隨著NRCF對(duì)成纖維細(xì)胞作用時(shí)間的增加，增殖也呈上升趨勢(shì)。在CCK-8法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果中均發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞的增殖高峰，發(fā)生在NRCF對(duì)其作用18 h后，說(shuō)明18 h是NRCF對(duì)成纖維細(xì)胞作用的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。Sorrell 和Caplan[6]驗(yàn)證了外周神經(jīng)損傷早期，大量的成纖維會(huì)聚集在損傷部位并發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)NRCF對(duì)成纖維細(xì)胞的促增殖作用，驗(yàn)證了大量成纖維細(xì)胞出現(xiàn)的原因。說(shuō)明NRCF能夠通過(guò)促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖作用促進(jìn)外周神經(jīng)的修復(fù)。

沃勒變性(wallerian degeneration, WD )是外周神經(jīng)系統(tǒng)最初級(jí)的反應(yīng)。它發(fā)生當(dāng)外傷性、中毒性、缺血性或代謝性事件發(fā)生時(shí)所引起的神經(jīng)纖維連續(xù)性的中斷[7]。WD包括軸索變性并伴隨脫髓鞘的發(fā)生。脫髓鞘的早期是由施旺細(xì)胞的去分化所引起，所以軸突的離斷，導(dǎo)致了施旺細(xì)胞之間缺少了聯(lián)系，與施旺細(xì)胞去分化的開(kāi)始有關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NRCF的濃度為1×104ng/ml時(shí)，可以促進(jìn)施旺細(xì)胞的增殖，同時(shí)也可以促進(jìn)施旺細(xì)胞去分化。軸突受損傷以后，施旺細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列變化，包括通過(guò)增殖和去分化來(lái)促進(jìn)軸突的再生[9-10]。本實(shí)驗(yàn)中也驗(yàn)證了這一點(diǎn)， NRCF能夠促進(jìn)施旺細(xì)胞的增殖和去分化，說(shuō)明NRCF能通過(guò)促進(jìn)施旺細(xì)胞的增殖和去分化來(lái)促進(jìn)軸突的再生。

軸突的損傷可引起一系列的事件，例如，血-神經(jīng)屏障破壞、施旺細(xì)胞的增殖、巨噬細(xì)胞的聚集[11-12]、神經(jīng)內(nèi)膜的空間重組、細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白的提高和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。NRCF是損傷局部發(fā)生的早期微環(huán)境，是神經(jīng)再生自我完善及自我調(diào)控機(jī)制充分發(fā)揮的重要條件[1]。本實(shí)驗(yàn)選取NRCF濃度為1×104ng/ml時(shí),已經(jīng)有效地證明了NRCF能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞和施旺細(xì)胞的增殖作用,以及促進(jìn)施旺細(xì)胞去分化的作用,進(jìn)而促進(jìn)外周神經(jīng)的修復(fù)和再生,體現(xiàn)其生物學(xué)特性。NRCF當(dāng)中存在大量的蛋白成分，但是對(duì)NRCF的提取、分離及對(duì)其中蛋白成分的檢測(cè)，也十分困難。因?yàn)槟Ｐ椭蠳RCF獲取的量有限，接下來(lái)我們還需要選取更多濃度進(jìn)行檢驗(yàn)，以明確NRCF對(duì)成纖維細(xì)胞和施旺細(xì)胞的最佳作用濃度和時(shí)間。另外，NRCF對(duì)成纖維細(xì)胞和施旺細(xì)胞的作用是通過(guò)其中的哪一種或者哪一些蛋白起到的作用，還需要我們進(jìn)一步地檢驗(yàn)，同時(shí)這種或這些蛋白通過(guò)什么途徑發(fā)揮的作用也需要我們做深入地研究，從而使NRCF在外周神經(jīng)損傷修復(fù)的臨床工作中發(fā)揮最大的生物學(xué)作用。

圖3 NRCF對(duì)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期中S期的影響圖4 NRCF對(duì)施旺細(xì)胞的細(xì)胞周期中S期的影響圖5 NRCF對(duì)施旺細(xì)胞的去分化作用 a. 對(duì)照組DMEM培養(yǎng)基 b. 實(shí)驗(yàn)組NRCF濃度為1×104ng/ml的培養(yǎng)基

Fig3 Effect of NRCF on Phase S of the cell cycle of fibroblasts.Fig4 Effect of NRCF on Phase S of the cell cycle of Schwann cells.Fig5 Effect of NRCF on dedifferentiation of Schwann cells. a. the control group with DMEM. b. the experimental group with DMEM including 1×104ng/ml NRCF.

[1] Bates DJ, Ranford JA, Mangelsdorf DC. Blot and culture analysis of neuronotrophic factors in nerve regeneration chamber flui-ds [J]. Neurochem Res, 1991,16(6):621-628.

[2] 楊新文, 王 勇. 黃芪誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2008,12(25):4996-5000.

[3] 李玉萍, 姜 浩, 李青峰, 等. 周?chē)窠?jīng)再生條件液中蛋白條帶質(zhì)譜分析[J]. 中國(guó)修復(fù)重建外科雜志, 2007,21(6):596-599.

[4] Lundborg G, Dahlin L, Danielsen N, et al. Trophism, tropism, and specificity in nerve regeneration[J]. J Recontr Microsurg, 1994,10(5):345.

[5] 李青峰, 徐魯平, 景乃禾, 等. 神經(jīng)再生條件液中活性蛋白的分離和檢測(cè)[J]. 中國(guó)修復(fù)重建外科雜志, 1999,13(4):199-201.

[6] Sorrell JM, Caplan AI. Fibroblasts----a diverse population at the center of it all[J]. Cell, 2009,276:161-214.

[7] Allodi I, Udina E, Navarro X. Specificity of peripheral nerve regeneration: Interactions at the axon level[J]. Prog Neurobiol, 2012,98(1):16-37.

[8] Jessen KR, Mirsky R. Negative regulation of myelination: relevance for development, injury, and demyelinating disease[J]. Glia, 2008,56(14):1552-1565.

[9] Fawcett JW, Keynes RJ. Peripheral nerve regeneration[J]. Annu Rev Neurosci, 1990,13:43-60.

[10] Nadim W, Anderson PN, Turmaine M. The role of Schwann-cells and basal lamina tubes in the regeneration of axons through long lengths of freeze-killed nerve grafts[J]. Neuropathol Appl Neurobiol, 1990,16(5):411-421.

[11] Perry VH, Brown MC. Role of macrophages in peripheral-nerve degeneration and repair [J]. Bioessays, 1992,14(6):401-406.

[12] Taskinen HS, R?oytt? M. The dynamics of macrophage recruitment after nerve transaction [J]. Acta Neuropathol, 1997,93(3):252.

EffectofnerveregenerationconditionedfluidonbiologicactivityoffibroblastsandSchwanncells

DINGShuang,LIQing-feng,LIGuang-shuai,etal.
(PlasticandCosmeticCenter,TheFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

ObjectiveTo explore the effect of nerve regeneration conditioned fluid on biologic activity of rat fibroblasts and schwann cells in vitro.MethodsThe rat fibroblasts and Schwann cells were cultured continuously in NRCF at the different concentrations for 24 hours. The cell proliferation, cell cycle and dedifferentiation of the Schwann cells were detected by Cell Counting Kit-8 (CCK-8), flow cytometry (FCM) and immunofluorescence, respectively.ResultsThe proliferation intensity of cultured cells increased with the increasing concentration of NRCF. The proliferation intensity of the fibroblasts and Schwann cells cultured with the same concentration of NRCF for 24 hours increased with the increasing hours. The changes of the cell cycle of fibroblasts and Schwann cells caused by NRCF occurred mainly at Phase S. NRCF had positive effect on promoting the dedifferentiation of Schwann cells.ConclusionNRCF can promote the proliferation of fibroblasts. NRCF can promote the proliferation and dedifferentiation of Schwann cells.

Peripheral nerve injury； Nerve regeneration conditioned fluids； Fibroblast ； Schwann cell； Proliferation； Dedifferentiation

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.04.019

R332

A

1673-7040(2014)04-0245-04

2014-01-09)

150001 黑龍江 哈爾濱，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 整形美容中心(丁 爽，于冬梅，羅 賽，郝立君);上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院 整復(fù)外科(李青峰，鄭 巖)；鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 整形外科(李廣帥)

丁 爽(1985)，女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生.

郝立君，150001，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 整形美容中心，電子信箱：lijun337@yahoo.com.cn