占美曉， 李 勇， 胡寶山， 何 旭， 黃建文， 陸驪工

近年來，以射頻消融術（RFA）為主的微創(chuàng)治療在早期肝癌治療中的療效越來越得到認可。然而研究發(fā)現(xiàn)RFA術后的5年復發(fā)率卻可高達70%，術后高復發(fā)率已成為影響患者RFA術后遠期療效的重要因素［1-2］。 對于血清甲胎蛋白（AFP）升高的肝癌患者，AFP常作為腫瘤標記物以預測腫瘤復發(fā)或預后。臨床上仍然有30%～40%患者AFP陰性（≤20 ng/ml），對此類患者，目前尚無理想的腫瘤標記物［3］。 microRNA（miRNA）是一類進化上高度保守的非編碼單鏈RNA，可影響細胞發(fā)育、分化、干細胞功能等多種病理生理過程，在腫瘤發(fā)生和轉移過程中亦發(fā)揮重要作用。近年，諸多研究已經(jīng)證實腫瘤組織中高表達的miRNAs可以釋放到循環(huán)血液中，且表達穩(wěn)定，循環(huán)miRNAs（血清或血漿等）被廣泛用于理想的腫瘤標記物［4-5］。本研究選擇的轉移相關miR-18b在肝癌組織中高表達且與腫瘤復發(fā)預后密切相關［6］，本研究重點探索miR-18b是否可以作為腫瘤標記物去監(jiān)測AFP陰性肝癌患者RFA術后復發(fā)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

2007年1月—2011年1月，我科診治的接受RFA治療的AFP陰性肝癌患者131例，收集患者RFA治療前1～2 d的血清標本。肝癌診斷標準根據(jù)衛(wèi)生部制定的原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2011年版），所有患者均行肝穿刺活檢病理確診為肝細胞癌。RFA治療儀器采用RITA射頻治療系統(tǒng)（美國）。納入的患者中男98例，女33例，平均年齡57.6歲；87例患者單病灶，44例患者多病灶 （2個或3個）；腫瘤平均直徑3.2 cm。我們選取43例健康體檢者的血清標本作為對照組，包括男31例，女12例。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會的批準且所有納入的研究者均獲得知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集 本組患者在RFA術前1～2 d采集靜脈血標本約8 ml，室溫下靜置30 min，靜置后于4℃1 500 r/min離心10 min。將上層血清吸出移至新的1.5 ml EP管，放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清miR-18b的檢測 所有血清樣本放置于冰上，每個樣本取300 μl轉移至含有750 μl TRI Reagent BD的新EP管中，依據(jù)TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）說明書抽提總 RNA，所有RNA通過分光光度計檢測并定量，提取好的RNA保存于-80℃冰箱內(nèi)。采用實時定量PCR技術檢測miR-18b 表達量［7］， 反轉錄總反應體系為 18 μl，PCR總反應體系為 19 μl。選擇 U6作為內(nèi)參基因，miR-18b的相對表達量用 2-ΔΔCT表示， 其中ΔCT肝癌患者/健康正常人= CTmiRNAs- CTU6；ΔΔCT =ΔCT肝癌患者- ΔCT健康正常人。

1.2.3 隨訪 隨訪截止時間為2012年5月。所有患者術后1個月行腹部增強CT觀察消融效果，RFA術后未能達到腫瘤完全消融的患者被排除于本研究。其后每3個月行腹部增強CT檢查及血清檢測AFP及肝功能指標以判斷有無出現(xiàn)復發(fā)或轉移。RFA術后復發(fā)形式主要有腫瘤局部進展、肝內(nèi)遠處復發(fā)及肝外轉移。

1.3 統(tǒng)計學分析

計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組血清miR-18b的表達差異及其同臨床病理資料間的關系用t檢驗或秩和檢驗。Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗分析miR-18b表達量同患者總生存率及無復發(fā)生存率的關系。數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-18b在肝癌患者中表達差異及相關的臨床病理因素

miR-18b在AFP陰性肝癌患者血清中表達水平顯著高于健康正常人（2.93±1.33對1.08±0.45，P＜0.01，圖1）。超過85%患者miR-18b表達上調(diào)的倍數(shù)在2倍以上。所有131例患者中，血清miR-18b表達水平上調(diào)的中位倍數(shù)為2.7倍。以3倍為分界點，我們將131例肝癌患者分為高表達組（66例）和低表達組（65例）。研究結果顯示：miR-18b表達水平差異與肝硬化、腫瘤直徑及腫瘤分化程度密切相關，而與性別、乙肝表面抗原、腫瘤數(shù)目等無明顯相關性（表1）。

2.2 血清miR-18b與肝癌患者RFA術后復發(fā)之間的關系

截止至末次隨訪日，共有79例患者（60.3%）出現(xiàn)復發(fā)。肝內(nèi)復發(fā)70例，包括13例肝內(nèi)腫瘤局部進展和57例肝內(nèi)遠處復發(fā)。16例出現(xiàn)肝外轉移，其中7例合并肝內(nèi)遠處和肝外轉移。結果顯示出現(xiàn)復發(fā)患者血清miR-18b的表達水平顯著高于無復發(fā)患者（3.26± 1.28比 2.42±0.86，P ＜0.01，圖 1）。根據(jù)復發(fā)的不同形式，進一步分析兩組血清miR-18b表達水平與復發(fā)率之間的關系顯示：miR-18b高表達組患者RFA術后肝內(nèi)遠處復發(fā)率 （P=0.018）和肝外轉移發(fā)生率（P=0.102）均高于低表達組（表2），而兩組在腫瘤局部進展發(fā)生率上無差異 （P=0.792）。

圖1 肝癌患者及健康正常人血清中miR-18b的表達水平

2.3 血清miR-18b與總生存率及無復發(fā)生存率的關系

表1 血清miR-18b表達高低同肝癌患者臨床病理因素間的關系

表2 血清miR-18b同RFA術后不同復發(fā)形式發(fā)生率之間的關系 n（%）

肝癌患者 1、3、5年總生存率分別為 86.3%、63.4% 、43.5% ；1、3、5 年 無 復 發(fā) 生 存 率 分 別 為64.9%、41.7%、29.0%。Kaplan-Meier生存分析顯示miR-18b高表達組患者總生存率和無復發(fā)生存率均顯著低于低表達組患者，差異均具有統(tǒng)計學意義（見圖 2）。

3 討論

圖2 miR-18b高低表達與RFA術后有無復發(fā)的比較

Kao 等［8］報道對于 AFP 升高的患者，RFA 術前術后AFP的變化可以預測肝癌患者的復發(fā)及總生存率。對于AFP陰性肝癌患者，有報道顯示血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等腫瘤標記物可以用來預測外科切除或肝動脈化療栓塞（TACE）術后腫瘤復發(fā)或轉移［9-10］。 本研究重點探索可以用于預測AFP陰性患者RFA術后腫瘤進展、預后的標記物，對判斷RFA術后患者的遠期療效意義重大。

血清miRNAs為腫瘤標記物的探索提供了新的視角。相比腫瘤組織取材，血清取樣具有創(chuàng)傷小、操作簡便、可重復性等優(yōu)點。本研究結果顯示肝癌患者血清中miR-18b的普遍高表達，且與肝硬化、腫瘤直徑及腫瘤分化程度相關。此研究結果與前期Murakami等［6］在腫瘤組織中觀察到 miR-18b的表達規(guī)律相一致。諸多證據(jù)已證實腫瘤組織或細胞內(nèi)特異的miRNAs在細胞破壞或病理損害的過程中會釋放到循環(huán)血液中，而在血清或血漿中穩(wěn)定表達［11-12］。肝癌RFA治療后腫瘤組織缺血、壞死，部分腫瘤細胞凋亡或停止增殖，因此我們有理由推測血清中高表達的miR-18b可能來自腫瘤組織熱消融過程中組織壞死釋放入血液中，血清miR-18b表達水平差異或可一定程度上反映腫瘤的消融壞死情況。

血清miRNAs除了可以用于腫瘤疾病的診斷外，如前列腺癌［13］、胃癌［5］等，還可以用于腫瘤患者不同方法治療后的療效評估。Zhao等［14］發(fā)現(xiàn)血漿miR-221可以預測乳腺癌患者新輔助化療的耐藥性的出現(xiàn)；Jung等［15］研究提示乳腺癌患者血漿miR-210表達水平顯著升高，且和曲妥珠單抗藥物敏感性、淋巴結轉移等密切相關。Murakami等［6］研究提示miR-18b通過調(diào)控靶基因TNRC6B的表達，在肝癌細胞轉移、血管侵犯、腫瘤進展等方面扮演重要角色，組織中高表達miR-18b或低表達TNRC6B的患者預后差，無復發(fā)生存率顯著降低。本研究通過結合特殊臨床特征的（AFP陰性）肝癌患者RFA術前血清miR-18b的表達水平和RFA術后復發(fā)轉移預后的情況進行分析，發(fā)現(xiàn)血清中高表達的miR-18b與RFA術后高復發(fā)率之間密切相關，且可以作為腫瘤標記物去預測肝癌患者RFA術后無復發(fā)生存率。除無復發(fā)生存率外，本研究結果也提示血清中miR-18b高表達的患者預后差，總生存率顯著低于表達組患者。

綜上所述，本研究結果提示血清miR-18b具有成為肝癌理想腫瘤標記物的優(yōu)勢，可用以監(jiān)測AFP陰性肝癌患者RFA術后復發(fā)和預測患者總生存率。miRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中調(diào)控的基因網(wǎng)絡復雜，常既充當“癌基因”又可充當“抑癌基因”的角色，因此在本研究的基礎上，以下問題后續(xù)仍需繼續(xù)探索：肝癌患者血清中其他轉移相關miRNAs（miR-151、miR-222、miR-30 d）的臨床價值的探索；能否聯(lián)合其他類型腫瘤標記物 （VEGF、缺氧誘導因子-1a等）去判斷腫瘤進展及預后；擴大樣本量，進一步驗證血清miR-18b的價值以便真正轉化臨床，使患者受益。

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