Hilary Sherman，Pilar Pardo，Todd Upton

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細(xì)胞的遷移性，趨化性和侵襲性的檢測方法

Hilary Sherman，Pilar Pardo，Todd Upton

200040 上海，康寧生命科學(xué)亞洲技術(shù)中心

細(xì)胞的遷移性，是指細(xì)胞受到外來信號(hào)的刺激，由一個(gè)地方遷移到另一個(gè)地方的特性，通常發(fā)生在比如傷口愈合、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育和腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中。細(xì)胞的侵襲性和遷移性相似，但不同的是，發(fā)生侵襲時(shí)，細(xì)胞需要降解一層胞外基質(zhì)（ECM）或者基底膜基質(zhì)（BME）進(jìn)而遷移到一個(gè)新的地方。當(dāng)正常細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，或者腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)都需要細(xì)胞的侵襲性。由此可見，了解這些特性的發(fā)生機(jī)制，對整個(gè)生物學(xué)研究有著重要而深遠(yuǎn)的意義。

由康寧公司研發(fā)的 transwell 培養(yǎng)設(shè)備的出現(xiàn)，為在體外研究細(xì)胞的趨化性和侵襲性提供了一種相對簡便的方法。通常的侵襲檢測系統(tǒng)是由膠原蛋白、纖連蛋白、層黏連蛋白等復(fù)雜的胞外基質(zhì)和基底膜基質(zhì)組成。還有更復(fù)雜的檢測手段是在復(fù)合蛋白層膜上培養(yǎng)單層表皮細(xì)胞。將分泌多種生長因子的細(xì)胞培養(yǎng)在可滲透層膜上作為趨化源的系統(tǒng)，也可以用于趨化性檢測或者更繁雜的侵襲性檢測。

下面所述的方法步驟是基于 BME 層膜的細(xì)胞侵襲性檢測，附以趨化性檢測為例（對于不含 BMC 和 ECM 層膜的侵襲性檢測也遵循類似的方法）。這里具體列出了以康寧 96 孔transwell 設(shè)備為例的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。對于不同規(guī)格的系統(tǒng)可以根據(jù)下面表格中的數(shù)據(jù)調(diào)整材料或試劑的用量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 非侵襲性 MCF-7 細(xì)胞系（人類乳腺癌細(xì)胞）、侵襲性 HT1080 細(xì)胞系（人類纖維肉瘤細(xì)胞）均購自美國 ATCC。

1.1.2 檢測平板類型 8 μm 孔徑的 96 孔 HTS transwell 培養(yǎng)系統(tǒng)、96 孔黑板、96孔黑色固相微型板、8 μm 孔徑的 6 孔transwell 培養(yǎng)系統(tǒng)、12 μm 孔徑的 12 孔 transwell 培養(yǎng)系統(tǒng)、8 μm 孔徑的 24 孔 transwell 培養(yǎng)系統(tǒng)、超低黏附 6 孔和 24 孔平板均為康寧公司產(chǎn)品。

1.1.3 試劑 5 × 基底膜提取物（BME）包被溶液、10 × 包被緩沖液、10 × 細(xì)胞裂解液均為美國 Trevigen 公司產(chǎn)品；用來消化收集細(xì)胞的HyQtase 消化液購自美國 Hyclone 公司；Calcein AM 鈣熒光素乙酰氧基甲酯（分子探針）以 1.67 μg/ml 的濃度溶解在 DMSO 中；含有 10% 胎牛血清的 IMDM 培養(yǎng)基、不含血清但含有 1 × ITS 的 IMDM 培養(yǎng)基購自美國 Invitrogen 公司。

1.1.4 設(shè)備 實(shí)驗(yàn)所需主要設(shè)備有37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱、生物安全柜和熒光檢測儀（具有 485 nm 的激發(fā)光和 520 nm 發(fā)射光的吸收檢測功能）。

1.2 方法

將細(xì)胞培養(yǎng)到足夠的數(shù)量并需單獨(dú)培養(yǎng)一盤相對濃度較低的細(xì)胞，以便做標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測。

第 1 天：將細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理，同時(shí)用基底膜提取物包被 transwell 設(shè)備；第 2 天：將細(xì)胞平鋪在 transwell 中，并用 FBS 作為誘導(dǎo)劑，可以同時(shí)考慮多加一個(gè)實(shí)驗(yàn)組用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；第 3 天：檢測通過基底膜的細(xì)胞數(shù)量，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞的密度應(yīng)該低于 80%，這樣可以保證經(jīng)過 24 h 饑餓處理的細(xì)胞也不會(huì)長得過于密集，吸去含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，輕輕地用 PBS 清洗細(xì)胞去除殘留的血清，用不含血清的 IMDM 培養(yǎng)細(xì)胞，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。

1.2.2 BME的包被 在檢測過程中，不同的細(xì)胞系所需的 BME 的最適濃度有所不同。對于特定的細(xì)胞系，建議做一個(gè)梯度檢測（比如從 0.1 × 到 1 × 稀釋）從中找出最適濃度。只有在最適的 BME 濃度下，才可以看到細(xì)胞的侵襲性和非侵襲性在趨化誘導(dǎo)作用下的最大差異。

⑴在無菌條件下，用無菌去離子水將 10 × 的包被儲(chǔ)液稀釋成 1 ×。

⑵將 5 × 的 BME 儲(chǔ)液放到 37 ℃水浴中，輕輕攪動(dòng)瓶子使其完全融化。融化后的 BME 儲(chǔ)液應(yīng)盡快稀釋或者放在冰上，否則其在稍高溫度下將會(huì)變得非常黏稠。

⑶用 1 × 的包被液將 5 × 的BME 稀釋到最適的濃度。

⑷用稀釋后的 BME 溶液包被 transwell（表 1）。

⑸將包被后的培養(yǎng)板放到 37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜。

1.2.3 平鋪細(xì)胞并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 以 HTS-96 transwell 為例詳細(xì)介紹細(xì)胞侵襲性檢測的步驟，其也同樣適用于其他不同規(guī)格的 transwell。實(shí)驗(yàn)過程中還需要另外再加一個(gè)陽性對照，即不經(jīng)過 BME 包被的 transwell 微孔，用于計(jì)算具有侵襲性的總的細(xì)胞數(shù)。

⑴使用 HyQtase 溶液或者其他合適的細(xì)胞消化液收集細(xì)胞。

⑵使用不含血清的培養(yǎng)基或者胰蛋白抑制劑終止消化。

表 1 推薦的 BME 溶液包被體積

注：*Corning transwell 6.5 mm 直徑的小室（24 孔板用），每包 12 個(gè)。

⑶離心去除上清，用不含血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。

⑷對細(xì)胞計(jì)數(shù)并以合適的濃度將細(xì)胞稀釋于含有血清的培養(yǎng)基中（表 2）。

表 2 推薦的細(xì)胞接種密度和體積

⑸將微孔中多余的 BME 吸出，同時(shí)將細(xì)胞平鋪在上面。

⑹留出至少一個(gè)孔不加細(xì)胞，作為陰性對照，以扣除背景值（圖 1）。

非侵襲性 MCF-7 細(xì)胞侵襲性HT1080 細(xì)胞 123456789101112 A B C D E F G H 不含 BME 的無血清培養(yǎng)基 含 BME 的無血清培養(yǎng)基 不含 BME 的培養(yǎng)基+ 10% FBS 含 BME 的培養(yǎng)基+ 10% FBS 空白對照

⑺在加有細(xì)胞的孔中，一些用不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)（即沒有趨化誘導(dǎo)），另外一些用含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)（即含有趨化因子），具體參照圖 1。

⑻根據(jù)所使用的細(xì)胞系的不同，培養(yǎng) 12 ~ 24 h。

1.2.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

⑴對于每一次的檢測和每一種細(xì)胞系都需要做出一個(gè)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

⑵將細(xì)胞消化并收集到一個(gè) EP 管中。

⑶用超純?nèi)ルx子水將 10 × 細(xì)胞裂解液配制成 1 × 細(xì)胞裂解液（1 × CDS）。

⑷將 Calcein AM 鈣熒光素乙酰氧基甲酯（50 μg）融化，加入 30 μl 的 DMSO 配制成工作濃度。

⑸離心收集細(xì)胞并重懸于 1 × CDS。

⑹將細(xì)胞稀釋成一系列不同濃度的細(xì)胞懸液，從最高濃度依次到不含細(xì)胞的 1 × CDS 溶液?？梢詤⒄毡?3 中推薦的細(xì)胞濃度梯度來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表 3 96 孔板中做標(biāo)準(zhǔn)曲線所需的細(xì)胞量

⑺從每一個(gè)濃度梯度中，吸取 50 μl 到 96 孔黑板（如果使用 96 孔 HTS 平板，選擇康寧 Cat.No.3583 產(chǎn)品，其他的選擇康寧 Cat.No.3916，每組做 3 個(gè)重復(fù)。

⑻用 1 × CDS 稀釋 Calcein AM 鈣熒光素乙酰氧基，按照每 1 ml 1 × CDS 加入 2.4 μl Calcein AM 溶液的比例進(jìn)行稀釋。

⑼在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的 96 孔板上，每孔加入 50 μl 的 Calcein AM/CDS 混合液。

⑽將 96 孔板在室溫下避光孵育 1 h，然后檢測其在 485 nm 激發(fā)光下 520 nm 處的熒光強(qiáng)度。

⑾對于每一個(gè)濃度梯度，計(jì)算出相應(yīng)的平均相對熒光強(qiáng)度（RFU），之后扣除背景值。

⑿繪制細(xì)胞濃度和 RFU 相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

⒀添加線性趨勢線（截距設(shè)為 0）y = mx + b，y 代表細(xì)胞數(shù)；x 代表 RFU。如圖 2 所示。

細(xì)胞數(shù)6 × 1045 × 1044 × 1043 × 1042 × 1041 × 1040 2.00E 4.00E 6.00E 8.00E 1.00E + 03 + 03 + 03 + 03 + 04 平均相對熒光強(qiáng)度

1.2.5 檢測

⑴用超純?nèi)ルx子水將 10 × 細(xì)胞裂解液稀釋成 1 ×（1 × CDS）。

⑵將 Calcein AM 鈣熒光素乙酰氧基甲酯（50 μg）融化，加入 30 μl 的 DMSO 配制成工作濃度。

⑶用 1 × CDS 稀釋 Calcein AM 鈣熒光素乙酰氧基，按照每 1 ml 1 × CDS 加入 1.2 μl Calcein AM 溶液的比例進(jìn)行稀釋。混合液應(yīng)避光保存。對于不同規(guī)格的 transwell，可以參照表 4 加入合適量的混合液。

表 4 推薦的 Calcein AM/1 × CDS 溶液體積

⑷從檢測板和 transwell 中吸出多余的培養(yǎng)基。

⑸用清洗緩沖液分別清洗 transwell 一次和檢測孔板 2 次。具體的量參照表 5。

表 5 洗脫液體積

⑹加入 Calcein AM/CDS 混合液到檢測板的微孔中。

⑺將 transwell 放到浸滿 Calcein AM/CDS 混合液的檢測板中。確保在 transwell 底部和孔板底部沒有空氣殘留。之后將整個(gè)檢測板放置于 37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中溫育 30 min。

⑻30 min 后，輕輕敲打孔板的側(cè)面，之后放回培養(yǎng)箱中再次溫育 30 min。

⑼從 96 孔檢測板中移出插入托盤，并輕輕晃動(dòng)以混勻細(xì)胞溶液。之后可以將檢測板直接放入檢測儀上進(jìn)行熒光強(qiáng)度的檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 收集數(shù)據(jù)。參見表 6a。

1.3.2 除背景值。背景即為沒有包被和細(xì)胞的對照組。參見表 6b。

1.3.3 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式將RLU 的值轉(zhuǎn)換成細(xì)胞數(shù)量。參照表 6c。

1.3.4 根據(jù)表 6c 中的細(xì)胞數(shù)量計(jì)算出通過基底膜的總的細(xì)胞數(shù)，然后乘以表 4 中的倍增系數(shù)，得出每孔侵襲細(xì)胞的百分比（表 6d）。

表 6a HT1080 細(xì)胞采用 96 孔 HTS transwell 板在讀板機(jī)上讀取的原始 RFU 數(shù)據(jù)示例（MCF-7 的數(shù)據(jù)未列出）

No BME,No FBSNo BME +10% FBSWith BME,No FBSWith BME +10% FBS 196 218 205195 216 208 45434885188569269374300639152845051 37334184517347289422273840181286830 394 6776 255292258652244595635 418371586715962793863 429438293687675776199 297 4941

表 6b 扣除背景之后的數(shù)據(jù)范例

No BME,No FBSNo BME +10% FBSWith BME,No FBSWith BME +10% FBS 0 0 0 0200*00 212* 25815283008351 69174100619750274839 17714582337128 8922273818979166618 198 6558 55 9258631042475426 218171386694760676651 22923893666473645987 97 4747 *: Average of multiple blank wells from table 6a, use for backgroundsubtract of test wells.

表 6c 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的每孔細(xì)胞量

No BME,No FBSNo BME +10% FBSWith BME,No FBSWith BME +10% FBS Solve for cell number (from figure 2): y = 5.9673x + 1236.5 277621445076551069164822751833382163123430112 229321025036543771176825611672501034847440728 2418 40370 156517851583388902658033615 253722573540426913744040925 260326571791410034518036963 1815 29563

表 6d 每孔侵襲細(xì)胞百分比

No BME,No FBSNo BME +10% FBSWith BME,No FBSWith BME +10% FBS Calculate % invasion = (cell concentration / initial cell seed)× multiplication factor (Table 4) 5.6%4.3%101.5%102.1%3.3%4.5%3.7%76.4%62.5%60.2% 4.6%4.2%100.7% 87.5%3.5%5.1%3.3%100.2%96.9%81.5% 4.8% 3.1%3.6%3.2%77.8%53.2%67.2% 5.1%4.5%7.1%85.4%74.9%81.9% 5.2%5.3%3.6%82.0%90.4%73.9% 3.6% 59.1%

1.3.5 通過基底膜的細(xì)胞數(shù)除以起始細(xì)胞數(shù)可以得到所有孔在相應(yīng)條件下的侵襲細(xì)胞百分比，從而得出結(jié)果（表 6e 和圖 3）。

表 6e 細(xì)胞侵襲和趨化性的平均百分比

No BME1 × BME 4.7% 4.4%–FBS 94.2%74.3%+FBS STD % invasion HT1080 No BME1 × BME 0.5% 1.2%–FBS 9.8%13.8%+FBS

2 討論

⑴對于非侵襲性細(xì)胞系，無論是否有趨化因子的誘導(dǎo)，都應(yīng)該沒有或者幾乎沒有細(xì)胞的遷移或者運(yùn)動(dòng)。

⑵在不含血清的培養(yǎng)基中生長的侵襲性細(xì)胞的遷移率應(yīng)該低于 10%。

圖 3 根據(jù)表 6e 數(shù)據(jù)做的柱狀圖

（包含 MCF-7 的數(shù)據(jù)）

⑶當(dāng)使用 FBS 進(jìn)行趨化誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞在 BME 包被和非包被的情況下，其遷移率的差異性應(yīng)該≥ 20%。

2014-09-01

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.015