元飛，陳五九，賈士儒，王欽宏

1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457

2 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

3-脫氫莽草酸 (3-dehydroshikimate, DHS)是微生物體內(nèi)芳香族氨基酸生物合成代謝途徑中的一種重要中間產(chǎn)物，對(duì)維系細(xì)胞正常生長(zhǎng)、完成代謝過(guò)程具有重要作用[1]。其進(jìn)一步加工可以合成原兒茶酸 (Protocatechuate)、香草醛(Vanillin)[2]、兒茶酚 (Catechol)[3]、沒(méi)食子酸(Gallate)及已二酸 (Adipate)[4]等一系列重要化工產(chǎn)品。利用DHS合成這些化工產(chǎn)品可以避免有毒的苯和甲苯等原料的使用，減少對(duì)人體和環(huán)境的影響。此外，DHS還是一種十分有效的抗氧化劑，其活性?xún)?yōu)于沒(méi)食子酸、丙基沒(méi)食子酸 (Propyl gallate)、BHQ (Tertbutylhydroquinone)、丁羥甲苯 (Butylatedhydroxytoluene，BHT)和生育酚 (α-tocopherol)等一些商品化的抗氧化劑[5]，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。另外，DHS作為一種小分子手性化合物，還可以作為藥物合成中非常有潛力的合成中間體[5]。因此，研究DHS的生產(chǎn)具有重要的應(yīng)用前景。

近年來(lái)，利用大腸桿菌等微生物合成 DHS受到極大關(guān)注[1,6-7]。在大腸桿菌中，DHS合成途徑如圖1[8]所示。莽草酸脫氫酶AroE負(fù)責(zé)將DHS轉(zhuǎn)化為莽草酸，所以通過(guò)突變或基因敲除aroE可以增加大腸桿菌積累DHS的能力[9]。合成途徑中轉(zhuǎn)酮醇酶基因 tktA是主要負(fù)責(zé)赤蘚糖-4-磷酸(E4P)合成的基因，會(huì)影響目標(biāo)產(chǎn)物DHS的合成[10]。3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶AroF影響 3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)的合成，其突變體AroFFBR增強(qiáng)了對(duì)代謝終產(chǎn)物芳香族氨基酸的抗反饋抑制抗性，可以促進(jìn) DAHP的合成，從而影響 DHS的生成[11]。另外細(xì)胞中副產(chǎn)物合成的存在經(jīng)常會(huì)影響目標(biāo)產(chǎn)物的合成，所以破壞某些副產(chǎn)物合成途徑可以有效提高目標(biāo)產(chǎn)物的合成[12-15]。

圖1 大腸桿菌中3-脫氫莽草酸的生物合成途徑[8]Fig. 1 3-dehydroshikimate biosynthetic pathway in E. coli[8]. E4P: D-erythrose 4-phosphate; PEP:phosphoenolpyruvate; DAHP: 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate; DHQ: 3-dehydroquinate; DHS:3-dehydroshikimate; TktA: transketolase; PpsA: PEP synthase; AroF: tyrosine-sensitive DAHP synthase; AroG:phenylalanine-sensitive DAHP synthase; AroH: tryptophan-sensitive DAHP synthase; AroB: DHQ synthase; AroD:DHQ dehydratase; AroE: shikimate dehydrogenase.

在上述分析的基礎(chǔ)上，本文以莽草酸脫氫酶aroE突變的大腸桿菌E. coli AB2834為出發(fā)菌株，首先通過(guò)增加tktA和aroFFBR共表達(dá)的拷貝數(shù)提高了DHS合成。然后，通過(guò)同源重組基因敲除技術(shù)敲除副產(chǎn)物合成途徑中的關(guān)鍵基因，降低副產(chǎn)物的積累，進(jìn)一步提高了DHS產(chǎn)量。最后，通過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵使工程菌株實(shí)現(xiàn)了較高的DHS生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本試驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒如表 1所示。生產(chǎn)DHS的出發(fā)菌株大腸桿菌 AB2834購(gòu)自美國(guó)Escherichia coli Genetic Stock Center，該菌是3-脫氫莽草酸脫氫酶突變菌 (aroE353)，即3-脫氫莽草酸到莽草酸合成途徑是被阻斷的；用于構(gòu)建質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司 (Beijing TransGen)。pKD8.292PL20-mCherry[16]、pET30a(+)和 pUC19分別是低、中和高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，用于不同拷貝數(shù)的tktA和aroFFBR共表達(dá)。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

主要試劑：氨芐青霉素、氯霉素、壯觀霉素、硫酸卡那霉素購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；DNA 回收試劑盒購(gòu)自 Tiangen公司；TransStart Fast Pfu DNA聚合酶，DNA Marker，pEASY-Blunt Cloning Kit試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、T4多聚核苷酸激酶購(gòu)自Fermentas公司；DHS標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

液體LB培養(yǎng)基 (g/L)： 胰蛋白酶蛋白胨10，酶酵母提取物5，氯化鈉5；121 ℃、15 min滅菌。對(duì)于固體LB，滅菌前向其中加入1.5%的瓊脂粉。氨芐青霉素、氯霉素、壯觀霉素、硫酸卡那霉素終濃度分別為100、25、50、50 μg/mL。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：Na2HPO46.78，KH2PO43，NaCl 0.5，NH4Cl 1，MgSO40.24，CaCl20.22，葡萄糖 20。其中 MgSO4和 CaCl2用0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌后加入培養(yǎng)基中，葡萄糖先溶于水配成500 g/L的溶液，115 ℃、20 min滅菌，用時(shí)按比例稀釋加入培養(yǎng)基中。對(duì)于E. coli AB2834、WJ002、WJ010、WJ022等aroE突變的4株菌株發(fā)酵時(shí)，加入終濃度為0.04 g/L的莽草酸。

發(fā)酵罐發(fā)酵種子培養(yǎng)基 (g/L)：胰蛋白酶蛋白胨10，酶酵母提取物5，氯化鈉5，葡萄糖20。

在施肥方法上，部分農(nóng)民施用“填鴨式”的施肥方式，盲目施肥，本著施肥“越多越好”的原則，造成肥料的浪費(fèi)和后期缺肥。隨著勞動(dòng)力成本增加、施用不適當(dāng)?shù)氖┓势骶?，化肥表施、淺施、撒施現(xiàn)象仍然普遍存在。據(jù)調(diào)查，小麥追肥有超過(guò)70%采用地表撒施的方法，蔬菜追肥大多數(shù)采取大水沖施的方式，造成肥料的大量現(xiàn)象。按常理來(lái)說(shuō)，每667平方米的冬小麥可以產(chǎn)出400-500kg，大約氮肥需要10kg左右的量，需要2500kg有機(jī)肥，按照這個(gè)需求比例完全可以滿足小麥生長(zhǎng)需求，如果肥料超過(guò)這個(gè)需求量，不僅會(huì)造成資源的浪費(fèi)，成本迅速增加，還會(huì)不利于作物的生長(zhǎng)。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO47.5，(NH4)2SO42.96，MgSO40.24，檸檬酸銨0.3，一水合檸檬酸2.1，苯丙氨酸0.7，酪氨酸0.7，色氨酸 0.7，對(duì)氨基苯甲酸 0.01，2,3-二羥基苯 甲酸0.01，對(duì)羥基苯甲酸0.01，(NH4)6(MO7O24)·4H2O 0.003 7, ZnSO4·7H2O 0.002 9，H3BO30.024 7，CuSO4·5H2O 0.002 5，MnCl2·4H2O 0.015 8，葡萄糖20。其中，KH2PO4、檸檬酸銨、一水合檸檬酸和 (NH4)2SO4配好后于121 ℃、15 min滅菌(滅菌前用KOH調(diào)pH至7.0)；葡萄糖配成500 g/L溶液，115 ℃、20 min滅菌，用時(shí)按比例稀釋加入培養(yǎng)基中；其他溶液用 0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，然后按比例稀釋加入培養(yǎng)基中。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

用于串聯(lián)表達(dá) aroFFBR和 tktA的質(zhì)粒包括pKD-Ptac-aroFFBR-tktA、pET-Ptac-aroFFBR-tktA和pUC-Ptac-aroFFBR-tktA，分別對(duì)應(yīng)低拷貝、中拷貝和高拷貝 (表 1)，其構(gòu)建方法如下，質(zhì)粒構(gòu)建相關(guān)引物見(jiàn)表2。

以質(zhì)粒 pKL4.130B 為模板，用引物Ptac-aroF-XhoI-5和aroF-SacI-3經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得Ptac-aroFFBR片段；以質(zhì)粒pKL4.130B為模板，用引物tktA-SacI-5和tktA-BglIXbaI-3經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得tktA片段。用SacⅠ分別酶切Ptac-aroFFBR和tktA的片段，然后連接兩個(gè)片段。以連接產(chǎn)物為模板，用Ptac-aroF-XhoI-5和tktA-BglIXbaI-3為引物，PCR擴(kuò)增得到Ptac-aroFFBR-tktA基因片段。

1) pET-Ptac-aroFFBR-tktA質(zhì)粒構(gòu)建：用Xho/ⅠXbaⅠ分別酶切pET30a (+)和PtacaroFFBR-tktA片段，分別膠回收目的片段，將得到的酶切純化產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在終濃度為50 μg/mL卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)，挑取5個(gè)克隆，提取質(zhì)粒DNA，用BamH/ⅠEcoRⅠ酶切驗(yàn)證，將正確的陽(yáng)性克隆命名為pET-Ptac-aroFFBR-tktA。

2) pUC-Ptac-aroFFBR-tktA質(zhì)粒構(gòu)建：用Sma/ⅠXbaⅠ酶切pUC19，膠回收純化目的片段，同時(shí)用XbaⅠ酶切Ptac-aroFFBR-tktA片段并進(jìn)行產(chǎn)物純化。然后連接前面得到的載體線性片段和外源基因片段，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在終濃度為 100 μg/mL氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)，挑取5個(gè)克隆，提取質(zhì)粒DNA，用Xho/ⅠXbaⅠ酶切驗(yàn)證，將正確的陽(yáng)性克隆命名為pUC-Ptac-aroFFBR-tktA。

3) pKD-Ptac-aroFFBR-tktA質(zhì)粒構(gòu)建：用Xho/ⅠXbaⅠ分別酶切pKD8.292-PL20-mCherry和pET-Ptac-aroFFBR-tktA質(zhì)粒并膠回收純化目的片段，連接得到的酶切純化產(chǎn)物，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在終濃度為50 μg/mL壯觀霉素的固體 LB培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)，挑取5個(gè)克隆，提取質(zhì)粒DNA，用Xho/ⅠXbaⅠ酶切驗(yàn)證，將正確的陽(yáng)性克隆命名為pKD-Ptac-aroFFBR-tktA質(zhì)粒。

1.2.2 基因敲除

以E. coli AB2834為出發(fā)菌株，利用兩輪同源重組無(wú)痕敲除基因技術(shù)[14]依次敲除出發(fā)菌株的乳酸、乙酸、乙醇等副產(chǎn)物合成途徑的關(guān)鍵基因，包括 ldhA (編碼乳酸脫氫酶基因)、ackA(編碼乙酸激酶A基因)和pta (編碼磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)與adhE (編碼乙醇脫氫酶基因)。敲除基因和相關(guān)同源重組DNA片段構(gòu)建的流程如圖2所示，所用的相關(guān)引物見(jiàn)表2，所得的基因敲除菌株如表1所示。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵和發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵

搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)：將保存于?80 ℃的菌種在加有相應(yīng)抗生素的平板上劃線，培養(yǎng)過(guò)夜，挑單

菌落到5 mL LB (15 mm×100 mm試管)中，培養(yǎng)含pET-Ptac-aroFFBR-tktA質(zhì)粒的菌株培養(yǎng)基中加硫酸卡那霉素，培養(yǎng)含pUC-Ptac-aroFFBR-tktA質(zhì)粒的菌株培養(yǎng)基中加氨芐青霉素，培養(yǎng)含pKD-Ptac-aroFFBR-tktA質(zhì)粒的菌株培養(yǎng)基中加壯觀霉素，37 ℃、220 r/min 過(guò)夜培養(yǎng) 12 h，測(cè) OD600值，保證起始 OD600=0.5，按相應(yīng)比例接種于20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基 (相應(yīng)抗生素)中 (100 mL 錐形瓶)，接種時(shí)加入0.2 mmol/L誘導(dǎo)劑IPTG (異丙基-?-D-硫代半乳糖苷)進(jìn)行誘導(dǎo)，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)。培養(yǎng)24?48 h后，收集菌液用于DHS產(chǎn)量的測(cè)定。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

圖2 兩輪同源重組法無(wú)痕敲除基因和相關(guān)同源重組DNA片段構(gòu)建的流程Fig. 2 Diagram for seamless gene disruption via two-round homologous recombination and the construction of DNA fragments for homologous recombination. (A)Gene disruption. (B)The construction of DNA fragments for homologous recombination.

發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)：在上述構(gòu)建的菌株中，選取搖瓶發(fā)酵中DHS產(chǎn)量最高的菌株進(jìn)行發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，挑單菌落接種于 5 mL(15 mm×100 mm試管)種子培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)12 h，再取5 mL培養(yǎng)液接種于200 mL種子培養(yǎng)基 (500 mL搖瓶)中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，然后將200 mL種子液全部接種于裝有4 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，在37 ℃、220 r/min，pH 7，溶氧20%的條件下發(fā)酵，通過(guò)氨水調(diào)控pH。發(fā)酵過(guò)程中根據(jù)培養(yǎng)基中殘?zhí)呛?、乙酸積累量和菌株的葡萄糖利用速率補(bǔ)加葡萄糖，補(bǔ)糖溶液濃度為600 g/L。在菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期加入終濃度 10 mg/L的IPTG，之后按相同量每6 h加一次IPTG，直到發(fā)酵結(jié)束。從6 h開(kāi)始，每隔4 h取一次樣，檢測(cè)發(fā)酵液中葡萄糖、乙酸和DHS等的含量。

1.2.4 代謝物和菌體量檢測(cè)方法

用高效液相色譜來(lái)確定發(fā)酵中底物葡萄糖消耗、產(chǎn)物DHS形成以及乳酸、乙酸和乙醇等副產(chǎn)物積累的情況。取1 mL發(fā)酵液于12 000 r/min離心 10 min，將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中。用去離子水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，振蕩混勻，制樣，上液相。檢測(cè)條件：VWD檢測(cè)器，Aminex HPX-878H 色譜柱 (300 mm×7.8 mm，9 μm)，流動(dòng)相為5 mmol/L硫酸，流速0.6 mL/min，柱溫63 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。每個(gè)待測(cè)樣品分別有 3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取自3個(gè)平行的平均值。用購(gòu)自Sigma公司的葡萄糖、DHS、乳酸、乙酸和乙醇等標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線。以水為空白，用分光光度計(jì)于600 nm處測(cè)定OD600值作為單位時(shí)間的菌體量。

2 結(jié)果與分析

2.1 aroFFBR和tktA不同拷貝數(shù)串聯(lián)表達(dá)對(duì)工程菌株DHS生產(chǎn)的影響

相關(guān)文獻(xiàn)研究表明，aroFFBR和tktA是影響菌株生產(chǎn)DHS的重要基因，它們分別可以通過(guò)影響相應(yīng)的中間產(chǎn)物DAHP和E4P的生成進(jìn)而影響DHS的合成[10-11]。另外，基因的拷貝數(shù)是影響工程菌株代謝工程改造的重要因素。因此，我們研究了aroFFBR和tktA不同拷貝數(shù)串聯(lián)表達(dá)對(duì)工程菌株 DHS生成的影響。不同拷貝數(shù)的aroFFBR和tktA串聯(lián)表達(dá)通過(guò)3個(gè)低、中和高拷貝的質(zhì)粒攜帶aroFFBR和tktA來(lái)實(shí)現(xiàn)。這3個(gè)質(zhì)粒 (pKD-Ptac-aroFFBR-tktA、pET-Ptac-aroFFBR-tktA和 pUC-Ptac-aroFFBR-tktA)帶有相同的啟動(dòng)子，利用這 3個(gè)質(zhì)?？梢员容^相同條件下，不同拷貝數(shù)的基因表達(dá)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物生成的影響。質(zhì)粒構(gòu)建完成后，用限制性?xún)?nèi)切酶及DNA測(cè)序分析進(jìn)一步確認(rèn)了所構(gòu)建的質(zhì)粒是正確的。

將上述構(gòu)建成功的3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入E. coli AB2834中，由于3個(gè)表達(dá)載體的拷貝數(shù)不同，其上攜帶的aroFFBR和tktA串聯(lián)基因的表達(dá)強(qiáng)度也不同。E. coli AB2834/pKD-Ptac-aroFFBR-tktA、E. coli AB2834/pET-Ptac-aroFFBR-tktA和E. coli AB2834/pUC-Ptac-aroFFBR-tktA這 3株重組菌與出發(fā)菌E. coli AB2834的搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)相比，DHS產(chǎn)量均有了不同程度提高，分別提高了14%、226%和293% (圖3)。其中，攜帶高拷貝pUC-Ptac-aroFFBR-tktA質(zhì)粒的菌株 DHS產(chǎn)量最高，為1.06 g/L。這表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，aroFFBR和 tktA串聯(lián)基因的表達(dá)載體拷貝數(shù)越高，所得重組菌株的DHS產(chǎn)量也越高。

2.2 阻斷副產(chǎn)物合成途徑對(duì)菌株DHS生成的影響

圖3 轉(zhuǎn)入pKD-Ptac-aroFFBR-tktA，pET-Ptac-aroFFBR-tktA和 pUC-Ptac-aroFFBR-tktA不同表達(dá)載體后 E. co li AB2834的DHS產(chǎn)量Fig. 3 DHS production of E. coli AB2834 harboring pKD-Ptac-aroFFBR-tktA, pET-Ptac-aroFFBR-tktA and pUC-Ptac-aroFFBR-tktA, respectively. A: E. coli AB2834;B: E. coli AB2834/pKD-Ptac-aroFFBR-tktA; C: E. coli AB2834/pET-Ptac-aroFFBR-tktA; D: E. coli AB2834/pUCPtac-aroFFBR-tktA.

由于菌株E. coli AB2834搖瓶發(fā)酵時(shí)乳酸、乙酸等副產(chǎn)物積累較多，而為了降低副產(chǎn)物積累，通過(guò)基因敲除降低副產(chǎn)物積累是常用的手段[19-21]。根據(jù)大腸桿菌基因組信息[22]，ldhA編碼乳酸脫氫酶，敲除ldhA經(jīng)常可以減少乳酸的生成。ackA和 pta基因的表達(dá)產(chǎn)物催化丙酮酸生成乙酸，敲除 ackA-pta基因可減少乙酸的生成。adhE編碼乙醇脫氫酶，敲除 adhE可以減少乙醇的生成。因此，本研究以E. coli AB2834菌株為出發(fā)菌，用兩輪同源重組無(wú)痕敲除基因技術(shù)依次敲除菌株的乳酸、乙酸和乙醇等副產(chǎn)物合成途徑中關(guān)鍵基因ldhA、ackA-pta和adhE，得到不同組合的基因敲除菌株 (表 1)。分別以gene-1-s (gene分別為 ldhA、ackA-pta和 adhE)和gene-2-a為引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證 (圖2B，引物序列見(jiàn)表 2)，ldhA敲除前，條帶大小為1 987 bp，敲除后應(yīng)為1 014 bp；ackA-pta敲除前后條帶大小分別應(yīng)為4 417 bp和975 bp；adhE敲除前后條帶大小分別應(yīng)為3 803 bp和1 087 bp。各基因敲除后 PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖 4所示，PCR結(jié)果與理論結(jié)果相同，表明成功敲除了這3個(gè)基因。通過(guò)基因敲除獲得了 3株不同組合副產(chǎn)物途徑基因敲除的重組菌，其對(duì)應(yīng)的基因特性見(jiàn)表1。

圖4 ldhA、ackA-pta和adhE 3個(gè)基因敲除的菌落PCR驗(yàn)證Fig. 4 Colony PCR verification of ldhA (A). ackA-pta(B)and adhE (C)gene knockout mutants of E. coli. (A)M: Trans 2K Plus DNA marker; 1: parent strain for ldhA knockout; 2: ldhA knockout strain. (B)3: parent strain for ackA-pta knockout; 4: ackA-pta knockout strain. (C)5: parent strain for adhE knockout; 6: adhE knockout strain.

把pUC-Ptac-aroFFBR-tktA分別轉(zhuǎn)入副產(chǎn)物合成途徑被破壞的菌株WJ002、WJ010和WJ022中，得到3株重組工程菌。與攜帶pUC-Ptac-aroFFBR-tktA的菌株E. coli AB2834/pUC-Ptac-aroFFBR-tktA相比，副產(chǎn)物合成途徑被破壞的菌株其DHS產(chǎn)量均有不同程度提高 (圖5)。敲除了ldhA后菌株WJ002/pUC-Ptac-aroFFBR-tktA的 DHS產(chǎn)量為1.37 g/L，較敲除前提高了29%。在此基礎(chǔ)上依次敲除了ackA-pta和adhE，DHS的產(chǎn)量也得到進(jìn)一步提高，最高可累積1.83 g/L DHS，與出發(fā)菌株相比提高了72.6%。該研究表明破壞菌株的副產(chǎn)物合成途徑，可以減少碳流量在分支途徑中的消耗，提高目標(biāo)產(chǎn)物DHS的產(chǎn)量。

與 E. coli AB2834相比，敲除了 ldhA、ackA-pta和adhE 3個(gè)基因的菌株E. coli WJ022，發(fā)酵過(guò)程中菌株糖耗增加，利用糖的能力增強(qiáng)，乙酸產(chǎn)量下降，OD600和乳酸變化不大 (表3)。另外，盡管敲除adhE前后都沒(méi)有檢測(cè)到乙醇的積累，但是敲除 adhE后使乙酸積累進(jìn)一步降低，從而導(dǎo)致DHS合成的進(jìn)一步增加，但是具體原因有待進(jìn)一步分析?？傊线m的副產(chǎn)物合成途徑關(guān)鍵基因敲除可以使更多碳流走向DHS合成途徑，使目標(biāo)產(chǎn)物DHS的產(chǎn)量得到明顯提高。

2.3 菌株E. coli WJ022/pUC-Ptac-aroFFBR-tktA的5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵

根據(jù)搖瓶發(fā)酵結(jié)果，選取DHS產(chǎn)量最高的菌株E. coli WJ022/pUC-Ptac-aroFFBR-tktA，進(jìn)行5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵。從發(fā)酵6 h開(kāi)始取樣，之后每4 h取一次樣，檢測(cè)樣品中乙酸、乳酸、殘余葡萄糖和DHS含量。根據(jù)發(fā)酵液中殘?zhí)呛鸵宜岬暮縼?lái)決定補(bǔ)加葡萄糖的量，補(bǔ)加原則是保持發(fā)酵液乙酸含量小于1 g/L，殘?zhí)呛坎桓哂?0 g/L。根據(jù)每4 h取樣測(cè)得的發(fā)酵液中乙酸含量，當(dāng)乙酸濃度很低或幾乎沒(méi)有乙酸時(shí)，補(bǔ)加葡萄糖；當(dāng)乙酸濃度接近或大于1 g/L時(shí)，停止補(bǔ)加葡萄糖。在這樣的補(bǔ)料條件下，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有檢測(cè)到乳酸生成；同時(shí)基本沒(méi)有乙酸積累。發(fā)酵62 h后菌株的DHS產(chǎn)量達(dá)到最大，為25.48 g/L。OD600為53.2。(圖6)整個(gè)過(guò)程糖耗經(jīng)核算相當(dāng)于187 g/L，所以DHS對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為0.14 g/g葡萄糖。

圖5 不同副產(chǎn)物合成途徑基因敲除后菌株的 DHS產(chǎn)量Fig. 5 DHS production of E. coli AB2834 with different gene disruption in by-product pathways. All strains were transformed with pUC-Ptac-aroFFBR-tktA. A:E. coli AB2834/pUC-Ptac-aroFFBR-tktA; B: E. coli WJ002/pUC-Ptac-aroFFBR-tktA; C: E. coli WJ010/pUCPtac-aroFFBR-tktA; D: E. coli WJ022/pUC-Ptac-aroFFBR-tktA.

表3 不同副產(chǎn)物途徑關(guān)鍵基因敲除的工程菌株糖耗、細(xì)胞生長(zhǎng)和副產(chǎn)物含量比較Table 3 Glucose consumption, cell growth and the formation of by-products in E. coli AB2834 with different gene disruption in by-product pathways

圖6 工程菌株 E. coli WJ022/pUC-Ptac-aroFFBR-tktA在5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)和DHS生產(chǎn)Fig. 6 Cell growth and DHS production of E. coli WJ022/pUC-Ptac-aroFFBR-tktA by 5 L fed-batch fermentation.OD600 (◇), concentration of DHS (▲).

3 討論

不同拷貝數(shù)的表達(dá)載體可使攜帶的目的基因進(jìn)行不同強(qiáng)度的表達(dá)，但并不是質(zhì)粒拷貝數(shù)越高，對(duì)于目的產(chǎn)物的累積越有利。位于一個(gè)多拷貝質(zhì)粒上的基因的表達(dá)有可能導(dǎo)致酶表達(dá)水平超過(guò)改善一個(gè)限速酶特性所需，這種代謝負(fù)擔(dān)常常會(huì)使菌株生長(zhǎng)率減慢，合成產(chǎn)物的產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率變低；本研究選用 3個(gè)不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為目的基因aroFFBR-tktA的表達(dá)載體，以期得到最適目的基因表達(dá)的載體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所用3個(gè)質(zhì)粒的拷貝數(shù)越高，菌株DHS產(chǎn)量也越高。所以最終選用拷貝數(shù)最高的 pUC-PtacaroFFBR-tktA質(zhì)粒用作目的基因的表達(dá)載體。另外通過(guò)合適地敲除菌株的一些副產(chǎn)物合成途徑的關(guān)鍵基因，使菌株利用糖的能力、生長(zhǎng)和副產(chǎn)物的合成等情況都發(fā)生了改變，從而使菌株的DHS產(chǎn)量得到了提高 (圖5和表3)。雖然敲除基因后并不一定明顯降低相應(yīng)副產(chǎn)物的合成，如在搖瓶發(fā)酵條件下，敲除菌株 E. coli AB2834的 ldhA后并沒(méi)有使菌株對(duì)應(yīng)的乳酸產(chǎn)量發(fā)生明顯下降，這可能與乳酸的另一條合成途徑，即通過(guò)丙酮醛合成乳酸有關(guān)[23]，因此需要進(jìn)一步敲除相關(guān)基因以減少乳酸的積累。

本研究通過(guò)對(duì)E. coli AB2834菌株DHS合成途徑中兩個(gè)重要酶DAHP合成酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的編碼基因aroFFBR和tktA進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)調(diào)控，使菌株在搖瓶發(fā)酵條件下的 DHS產(chǎn)量提高了2.93倍。然后通過(guò)基因敲除破壞與目的產(chǎn)物DHS合成途徑無(wú)關(guān)的一些副產(chǎn)物合成途徑，使工程菌株搖瓶發(fā)酵條件下DHS產(chǎn)量進(jìn)一步提高了72.6%，達(dá)到1.83 g/L。然后用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，最終使工程菌株的DHS產(chǎn)量在發(fā)酵62 h后達(dá)到了25.48 g/L，為目前國(guó)內(nèi)報(bào)道的最高水平。我們的研究為實(shí)現(xiàn)有應(yīng)用前景的DHS生產(chǎn)菌構(gòu)建及生產(chǎn)提供了重要參考。此外，大腸桿菌的DHS合成途徑中還有許多重要基因，如 aroD、aroG和 aroH[24-25]可以進(jìn)行改造優(yōu)化，這將是進(jìn)一步代謝工程改造DHS生產(chǎn)菌株的研究方向。

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