麥茵，張振宇，董培越，楊浩，楊公社，孫世鐸

西北農(nóng)林科技大學 動物脂肪沉積與肌肉發(fā)育實驗室，陜西 楊凌 712100

骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制劑 (BMP and Activin receptor Membrane Bound Inhibitor，BAMBI)于1998年在非洲爪蟾蜍卵母細胞中篩選與 BMP4基因表達譜中發(fā)現(xiàn)，而在 1999年Onichtchouk等在非洲爪蟾蜍中也發(fā)現(xiàn)了一種與BMP4表達模式相似的互補 DNA，正式將其命名為BAMBI[1-2]。BAMBI蛋白質(zhì)的氨基酸序列與nma有89%的相似性，因此BAMBI也可稱為nma,研究證明 nma位于人的 10號染色體p11.2-p12.3區(qū)域[3]。而組織差異實驗也表明，nma即BAMBI在人肝臟髓質(zhì)、胎盤以及脾臟中高表達，在腎臟皮質(zhì)、肝臟、前列腺和腸中穩(wěn)定表達，在肺及肌肉中不表達[3]。隨后在小鼠中的組織差異表達則表明，BAMBI在小鼠的心臟、肺以及睪丸中高表達，在腦、肝臟以及腎臟中低表達[4]。

大量的研究證明，BAMBI在各個組織中廣泛表達，且在脊椎動物中保守表達，因此BAMBI可能參與機體的多種代謝過程，是一種重要的功能型蛋白。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn) BAMBI是一種橫跨膜糖蛋白，其編碼的產(chǎn)物含有260個氨基酸[1]。BAMBI的結(jié)構(gòu)與TGF超家族的Ⅰ型受體(TGF-βRΙ/BMP-RΙ)的結(jié)構(gòu)相似，其胞外域與 TGF-βRΙ/BMP-RΙ十分相似，但是其胞內(nèi)域與之相比，較短且缺乏絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域[1,4]，故其被認為是TGF-β信號通路的偽受體。目前，BAMBI的研究主要集中在腫瘤細胞、胚胎發(fā)育、牙形成以及血管生成方面的作用研究[5-7]。最近的研究表明，敲除 BAMBI后增加了由TGF-β刺激的SMAD1/5和ERK1/2的磷酸化進而調(diào)控血管生成[7]。ERK1/2信號通路在調(diào)控細胞增殖與分化等生理學過程中發(fā)揮重要的作用。研究表明，ERK1/2在 3T3-L1細胞脂肪形成的過程中起負調(diào)控的作用[8-9]。

由以上的研究推測，BAMBI可能通過ERK1/2信號通路脂肪細胞分化。為驗證BMABI的生物學功能，構(gòu)建慢病毒干擾載體，感染豬前體脂肪細胞，探討其對脂肪細胞分化的影響，為深入研究其在豬前體脂肪細胞分化過程中調(diào)控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1–3日齡健康關中黑豬。慢病毒載體系統(tǒng)和293T細胞系由實驗室保存。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ及XhoⅠ，T4 DNA連接酶，Taq DNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄和Real-time PCR試劑盒、Trizol購于日本TaKaRa公司；Opti-MEM、DMEM、DMEM/F12、Ⅰ型膠原酶、胎牛血清均購自美國Gibco公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均購于BioFlux公司；Western blotting所用抗體均購自Santa公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 豬 pLentiH1-BAMBI shRNA的構(gòu)建

根據(jù) NCBI中報道的豬 BAMBI基因序列(GenBank Accession No. NM_001201485)，利用Invitrogen公司在線軟件 ranidesigener (https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/)設計BAMBI干擾引物，在中間添加loop環(huán)和兩端添加BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點后，由上海生工生物工程有限公司合成3對shRNA Oligo DNA序列 (表 1)。將合成的單鏈寡核苷酸退火形成雙鏈，與經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后的pLenti-H1載體連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆擴繁并提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，送南京金斯瑞公司測序。

1.2.2 病毒包裝、濃縮及滴度測定

磷酸鈣法轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前 24 h以 2×104/cm2密度將 HEK293T細胞接種到 10 cm皿中，加8 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，包裝前2?4 h將培養(yǎng)基更換為 8 mL新鮮培養(yǎng)基，10 μg pLentiH1-Akt2 shRNA，6 μg VSVG，6 μg Δ8.9加入高壓滅菌的雙蒸水中，使總體積為480 μL，渦旋使混勻；將520 μL 0.5 mol/L CaCl2加入質(zhì)?；旌衔镏校瑴u旋混勻；將 20 μL 70 mmol/L NaH2PO4和980 μL的HN緩沖液混勻為HNP緩沖液，將1 000 μL HNP緩沖液用200 μL移液槍邊渦旋邊滴加入質(zhì)?；旌衔镏校皇覝仂o置15 min以形成沉淀；用200 μL移液槍將混合物滴加入培養(yǎng)皿中；14?16 h后換為新鮮培養(yǎng)基；48 h和72 h后收集含有病毒的上清液，3 000 r/min離心10 min，去除細胞碎片，0.45 μm的PVDF膜過濾。按照10倍倍比稀釋病毒，得到100?10–6濃度梯度，分別感染293T細胞，2 d后觀察熒光表達情況，計算病毒滴度，計算公式為：病毒滴度(TU/mL)=GFP陽性細胞數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)/0.01 mL。

表1 豬BAMBI基因shRNA設計Table 1 shRNA oligo DNA targeting porcine BAMBI CDS

1.2.3 豬前體脂肪細胞培養(yǎng)

無菌狀態(tài)下采集健康 3日齡仔豬背部皮下脂肪組織，用含雙抗的PBS緩沖液浸泡、沖洗3次，剪成約1 mm3的組織塊，向剪碎的組織塊中加入1 mg/mLⅠ型膠原酶消化液，置37 ℃振蕩搖床內(nèi)溫育60?80 min后取出，經(jīng)200目鋼篩過濾、離心、重懸以后，以5.0×104個/cm2密度接種至培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，12 h后更換培養(yǎng)基，之后每2 d換液1次。

1.2.4 慢病毒感染豬前體脂肪細胞

待3.5 cm培養(yǎng)皿中豬前體脂肪細胞融合率達 70%?80%時，吸去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，加入2 mL 病毒原液，200 μL FBS，2 μL 聚凝胺，設置空白對照，孵育24 h后，換為新鮮培養(yǎng)基。

1.2.5 Real-time PCR分析

豬前體脂肪細胞感染慢病毒48 h后觀察熒光強度，收集細胞，PBS洗2次后，加入1 mL Trizol試劑，按TaKaRa提供的Trizol使用說明書提取細胞總 RNA[10]。根據(jù) GenBank中豬BAMBI、β-actin、PPARγ和 ap2 mRNA 序列，應用Primer Primer5.0設計PCR擴增引物，送上海生工公司合成，引物相關參數(shù)見表2。

1.2.6 Western blotting

豬前體脂肪細胞感染慢病毒72 h后觀察熒光強度，收集細胞，用蛋白裂解液提取細胞總蛋白；豬前體脂肪細胞感染慢病毒2 d后，誘導分化，用含有1 μmol/L地塞米松，5 μg/mL胰島素，0.5 μmol/L IBMX (3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)的DMEM/F12誘導液誘導2 d，后用含5 μg/mL胰島素的DMEM/F12的維持液培養(yǎng)4 d后棄去培養(yǎng)基，收集細胞，用蛋白裂解液提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整總蛋白濃度后，按1∶4加入5×上樣緩沖液，煮沸15 min，用 5%?12%預制膠進行電泳分離，電泳完畢后電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗孵育2 h，二抗孵育2 h，最后用化學發(fā)光法顯示結(jié)果。

1.2.7 油紅O染色和油紅O提取比色法

病毒感染豬前體脂肪細胞后，進行成脂誘導分化，6 d后吸出培養(yǎng)基，PBS 3次，4%多聚甲醛固定45 min，PBS洗3次，油紅O工作液染色45 min，PBS洗3次，倒置顯微鏡下觀察照相。另取一部分細胞按照以上方法固定、染色、沖洗后，加入2 mL異丙醇提取與脂滴結(jié)合的油紅O染料，以相同處理為空白對照，在波長510 nm處測量，記錄吸光度值 (OD)。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤 (x±s)表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件One-way ANOVA進行方差分析與顯著性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 pLentiH1-BAMBI shRNA構(gòu)建與包裝

將合成的3對shRNA Oligo DNA退火后，電泳可見一條單一的，大小為59 bp的條帶 (圖1A)。隨后，對pLentiH1空載質(zhì)粒進行酶切，酶切后電泳可見2個片段，大片段為7 612 bp，小片段為209 bp (圖1B)，說明酶切成功，可用于后續(xù)實驗。膠回收大片段產(chǎn)物，與退火產(chǎn)物進行連接，轉(zhuǎn)化DH5α，涂板后挑取陽性克隆，搖菌，提質(zhì)粒，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pLentiH1-BAMBI shRNA得到長度為59 bp的片段 (圖1C)，后送公司測序驗證，測序結(jié)果正確，載體構(gòu)建成功。

表2 Real-time PCR特異引物Table 2 Specific primers for Real-time PCR

2.2 慢病毒的包裝及感染豬前體脂肪細胞

將慢病毒重組質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒Δ8.9和包裝質(zhì)粒VSVG共轉(zhuǎn)染293T細胞，分別于24、48和72 h在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達情況。結(jié)果顯示，48 h后細胞生長良好，已經(jīng)有90%以上細胞表達綠色熒光蛋白，表明包裝成功 (圖2)。同時，在48、72 h收集病毒上清液。待豬前體脂肪細胞細胞融合率達到70%?80%時，用病毒上清液感染豬前體脂肪細胞，48 h后熒光顯微鏡下觀察，可見50%以上的細胞發(fā)綠色熒光 (圖 3)，表明慢病毒已經(jīng)整合到細胞基因組，并開始表達GFP和干擾片段。

圖1 BAMBI慢病毒載體的構(gòu)建Fig. 1 Construction of BAMBI lentivirus vectors. (A)shRNA Oligo DNA was annealed to double-stranded DNA.M: DNA marker; 1?3: BAMBI shRNA1, 2 and 3 Oligo DNA annealing product (58 bp). (B)pLentiH1 blank plasmids was identified by restriction enzyme digestion BamHⅠand XhoⅠ). M1: DNA marker 1; 1?5: enzyme digestion product by BamHⅠand XhoⅠ; M2: DNA marker 2; (C)pLentiH1-BAMBI shRNA recombinant plasmids were identified by restriction enzyme digestion (BamH I and XhoⅠ).M: DNA marker; sh1–sh3: enzyme digestion product of pLentiH1-BAMBI shRNA1, 2 and 3.

圖2 BAMBI重組慢病毒的產(chǎn)生Fig. 2 Production of BAMBI recombinant lentivirus. (A, E)Transfected with pLentiH1-BAMBI shRNA1. (B, F)Transfected with pLentiH1-BAMBI shRNA2. (C, G)Transfected with pLentiH1-BAMBI shRNA2. (D, J)Transfected with pLentiH1 scrambled. (A, B, C, D)Examined under amicroscope (40×). (E, F, G, H)Examined under amicroscope (100×).

2.3 慢病毒感染豬前體脂肪細胞后對 BAMBI基因表達的影響

用 pLentiH1-BAMBI shRNA1、2、3以及scrambled慢病毒感染豬前體脂肪細胞，48 h和72 h后分別收集RNA和蛋白，采用real-time PCR檢測干擾片段對 BAMBI基因的干擾效率，其中shRNA2的干擾效率達到 60%，高于 50%，達到預期效果，可用于后續(xù)實驗 (圖4A)，將其重新命名為sh-BAMBI。Western blotting檢測結(jié)果也顯示，感染了shRNA2的豬前體脂肪細胞，BAMBI蛋白表達顯著降低 (圖4B)。結(jié)果表明，構(gòu)建的慢病毒能夠有效抑制豬前體細胞中BAMBI的表達。

圖3 重組慢病毒感染豬前體脂肪細胞2 d后GFP表達Fig. 3 GFP expression in porcine preadipocytes infected with lentivirus 2 days later (100×). (A–C)Porcine preadipocyte infected by lentivirus containing BAMBI shRNA1, 2 and 3. (D)Porcine preadipocyte infected by lentivirus containing scrambled, as control.

圖4 重組慢病毒感染豬前體脂肪細胞后BAMBI的mRNA及蛋白水平的表達Fig. 4 Expression of BAMBI mRNA and protein in porcine preadipocytes infected with lentiviru. (A)Real-time PCR analysis BAMBI and β-actin mRNA expression in porcine preadipocytes infected by lentivirus including BAMBI and scrambled shRNA. Noinfected and scrambled as controls, β-actin as internal control. (B)Western blotting analysis of BAMBI and β-actin protein expression in porcine preadipocytes infected by lentivirus including BAMBI and scrambled shRNA. Noinfected and scrambled as controls, β-actin as internal control. ** P＜0. 01; *** P<0.001.

2.4 干擾BAMBI后促進豬前體脂肪細胞分化

慢病毒病毒感染豬前體脂肪細胞，進行誘導分化，6 d后進行油紅O染色及提取，同時，提取細胞總RNA，利用Real-time PCR檢測細胞中過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARγ)、和脂肪細胞型脂肪酸結(jié)合蛋白 (ap2)mRNA 表達情況。油紅O染色結(jié)果表明，BAMBI干擾后細胞中的脂滴量明顯增加 (圖5A)。油紅O提取比色法結(jié)果也顯示，降低BAMBI的表達促進了豬前體脂肪細胞脂質(zhì)累積 (圖 5B)。Real-time PCR檢測結(jié)果則表明，BAMBI干擾處理組與對照組相比PPARγ和ap2 mRNA表達顯著升高，其中PPARγ水平上調(diào)約2.2倍，ap2水平上調(diào)約2.1倍 (圖6A)。蛋白水平的檢測表明，干擾BAMBI后PPARγ和ap2的蛋白水平升高了，此外，磷酸化的 ERK1/2水平降低了 (圖 6B)。因此，BAMBI可能通過ERK1/2信號通路抑制豬前體脂肪細胞分化。

圖5 BAMBI干擾對豬前體脂肪細胞分化的影響Fig. 5 Effects of interference of BAMBI on pig preadipocyte differentiation. (A)Oil red O staining of porcine preadipocytesat at day 6 after differentiation (100×). After infected by lentivirus preadipocytes were induced for 6 days to differentiate by cocktail way. a, b and c: adipocytes before staining; d, e and f: adipocytes by oil red O staining. a and d: adipocytes not be infected lentivirus; b and e: adipocytes infected by lentivirus includingnonsense shRNA; c and f: adipocytes infected by lentivirus including BAMBI shRNA2. (B)Quantitative analysis of the Oil Red O staining, the accumulation of lipid droplets in shRNA2 treated group was increased. **P<0.01.

圖6 豬前體脂肪細胞干擾BAMBI后對PPARγ和ap2的表達以及ERK1/2信號通路的影響Fig. 6 Effect of PPARγ, ap2 and ERK1/2 signaling pathway in porcine preadipocytes lacking BAMBI. Preadipocytes were infected with lentivirus and induced for 6 days by cocktail way. Total RNAs were collected 6 days later. The expression levels of PPARγ and ap2 were measured by real-time PCR and Western blotting, the activity of ERK1/2 was detected by Western blotting. Results were normalized by β-actin. (A)The mRNA levels of PPARγ and ap2. (B)The protein expression of PPARγ, ap2 and ERK1/2 signaling pathway. *P<0.05, **P<0.01. Noninfected: adipocytes did not be infected by lentivirus; scrambled: infected by lentivirus including scrambled shRNA; sh-BAMBI: adipocytes infected by lentivirus including BAMBI shRNA2; p-ERK1/2: the phosphorylation level of ERK1/2.

3 討論

肥胖是機體內(nèi)脂肪細胞數(shù)目和大小的增加導致脂肪組織過度積累造成的，它成為21世紀人類生存危機之一[11]。肥胖更容易引發(fā)Ⅱ型糖尿病、高血壓、高血脂、動脈硬化等疾病，因此，了解脂肪沉積的調(diào)控機制成為近年來的熱點問題[12]。大量研究表明，脂肪形成過程受到一個復雜的網(wǎng)絡調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)BAMBI可能是一個新的調(diào)節(jié)脂肪細胞分化的因子。

近年來，BAMBI作為TGF-β超家族的偽受體，在腫瘤細胞中有大量的研究。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細胞中過表達 BAMBI阻斷了癌細胞對 TGF-β信號通路的反應[13]。人的 BAMBI基因 (hBAMBI)可以抑制TGF-β和BMP介導的轉(zhuǎn)錄應答以及TGF-β誘導的R-Smads磷酸化，hBAMBI還可以通過與Smad7、ALK5形成三元復合物抑制了ALK5和R-Smads的相互作用從而抑制TGF-β信號通路[14]。Sekiya等[15]證明，TGF-β信號通路中的Smad3和Smad4與BAMBI的啟動子相結(jié)合，從而使得 TGF-β信號通路調(diào)節(jié)BAMBI的轉(zhuǎn)錄。而最近的研究則發(fā)現(xiàn)，作為偽受體的BAMBI在血管形成過程中通過TGF-β信號通路調(diào)節(jié) ERK1/2的磷酸化水平發(fā)揮作用[7]。研究顯示，ERK1/2信號通路在脂肪細胞分化過程中發(fā)揮關鍵的作用[16]。在分化的早期階段抑制 ERK1/2信號通路可以抑制脂肪的形成[17]。雖然有研究認為ERK1/2信號通路促進了脂肪細胞分化[18]。但是，許多的研究也表明ERK1/2信號通路在脂肪形成過程中發(fā)揮負調(diào)控作用。MacDougald等發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的激活ERK1/2信號通路可以抑制脂肪細胞分化[19]。ERK1/2信號通路是通過增加PPARγ的磷酸化水平，從而抑制其活性，進而抑制脂肪形成[16,20]。此外，Zang等發(fā)現(xiàn)Brd2增加ERK1/2的磷酸化水平，進而增加了PPARγ的磷酸化水平，導致PPARγ的降解，最后抑制脂質(zhì)沉積[21]。因此，我們推測BAMBI可能通過調(diào)控ERK1/2的活性調(diào)控脂肪形成。

本研究采用了慢病毒介導的RNA干擾，該方法可應用于難以干擾的細胞，并且在感染后能與宿主細胞基因整合，實現(xiàn)長期的穩(wěn)定表達[22]。此外，使用磷酸鈣法對慢病毒干擾載體進行包裝，與脂質(zhì)體法相比，前者可達到后者的轉(zhuǎn)染效率，并且不需更換無雙抗培養(yǎng)基，降低了細胞污染的概率，此外，還節(jié)約了實驗的成本[23]。而為了進一步保證慢病毒的侵染效率，在侵染時慢病毒中混入了0.1%的polybrene。實驗中，成功構(gòu)建了豬BAMBI干擾載體，研究結(jié)果表明，構(gòu)建的BAMBI慢病毒干擾載體可有效的干擾BMABI的mRNA和蛋白的表達。為進一步研究 BAMBI對脂肪細胞分化的作用機理奠定了基礎。此外，以豬前體脂肪細胞作為研究材料，一方面可以為 BAMBI調(diào)控豬脂肪沉積，進而影響胴體品質(zhì)提供思路；另一方面，豬在生理特性與脂肪沉積的調(diào)控機理有很高的相似性[24]，是合適的動物模型，可為治療肥胖及其相關疾病提供新的靶點。

通過油紅O染色及油紅O提取比色法檢測發(fā)現(xiàn)，BAMBI慢病毒干擾載體干擾BAMBI表達后，豬前體脂肪細胞中的脂質(zhì)積累增加了，說明抑制 BAMBI的表達能夠促進豬前體脂肪細胞分化。PPARγ和 ap2分別在啟動前體脂肪細胞分化與脂肪細胞成熟階段發(fā)揮重要的作用，因此，它們作為脂肪細胞分化的標志基因[25-26]。為了進一步確定干擾BAMBI后對豬脂肪形成的影響，我們通過實時定量PCR檢測了PPARγ和 ap2的表達情況，檢測結(jié)果表明，干擾BAMBI后，PPARγ和ap2的表達水平顯著上升。此外，我們發(fā)現(xiàn)干擾 BAMBI后，ERK1/2的磷酸化水平降低了，即 ERK1/2的活性降低了。因此，BAMBI基因可能通過促進 ERK1/2的活性抑制豬前體脂肪細胞分化。但是，BAMBI是否是通過提高ERK1/2的活性，進而降解抑制PPARγ的活性，從而調(diào)控脂肪形成還需要進一步的研究。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了豬 BAMBI慢病毒干擾載體，獲得高感染力的病毒并成功感染豬前體脂肪細胞，有效地抑制了 BAMBI的表達。BAMBI沉默通過抑制ERK1/2的活性促進了豬前體脂肪細胞分化，表明BAMBI通過ERK1/2信號通路對豬前體脂肪細胞分化起負調(diào)控的作用。這些結(jié)果都為進一步研究 BAMBI調(diào)控脂肪細胞分化的作用機理提供了理論依據(jù)。

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