程飛飛，楊智，錢程,

1 浙江理工大學生命科學學院 新元醫(yī)學與生物技術研究所，浙江 杭州 310018

2 第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院病理學研究所西南癌癥中心，重慶 400038

近年來，干細胞移植治療因其在組織和器官修復等方面的重要應用前景成為當今再生醫(yī)學研究領域的熱點[1-4]。目前，研究人員發(fā)現(xiàn)，以骨髓間充質干細胞 (Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)和脂肪來源干細胞 (Adipose-derived stem cells, ASCs)為代表的成體干細胞不僅來源較豐富，具有多向分化能力、可塑性強及便于體外操作的優(yōu)點，而且免疫原性較低、可實現(xiàn)個體化治療[3-6]。因此，成體干細胞成為當前干細胞移植治療以及組織工程研究中最重要的干細胞來源。可是，BMSCs和 ASCs在干細胞移植治療以及組織工程應用中都還存在著自身局限性。例如，BMSCs來源有限，取材時會造成創(chuàng)傷，并且體外傳代后容易發(fā)生老化[7-8]；而 ASCs雖然來源較豐富，并且可通過微創(chuàng)或無創(chuàng)的方式獲取，但它具有不易于分離、勻質性差、成脂分化率低和對供者年齡要求較高等缺點[9-10]。由于這些局限性，BMSCs和ASCs未能充分滿足干細胞移植治療和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)組織工程產(chǎn)品的需要。因此，探尋一種來源廣泛、易于分離、增殖能力強且免疫原性低的更優(yōu)秀的種子細胞對于干細胞移植治療以及組織工程研究均具有重大理論與實踐意義。

去分化脂肪 (Dedifferentiated fat, DFAT)細胞是由人體內含量最豐富的成熟脂肪細胞經(jīng)體外天花板法培養(yǎng)去分化而來，并且有著類似于成體干細胞的特性[11-13]?，F(xiàn)有研究表明，DFAT細胞具有來源豐富，均一性高，增殖能力和成脂、成骨能力強，對供者年齡要求低及免疫原性較低等特點[12-15]。相比于BMSCs和ASCs等成體干細胞，它更能滿足干細胞移植治療和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需要 (表1)。本文從DFAT細胞的臨床應用優(yōu)勢、免疫學性質、體內外多向分化能力及臨床前動物實驗研究等方面對其研究進展作一概述。

表1 MSCs, ASCs和DFAT細胞的特點比較[12-15]Table 1 Comparison on the properties of MSCs, ASCs and DFAT cells[12-15]

1 DFAT細胞的臨床應用優(yōu)勢

國內外的研究發(fā)現(xiàn)，DFAT細胞具有以下臨床應用優(yōu)勢：1) DFAT細胞由人體內含量最豐富的成熟脂肪細胞去分化而來。相比于BMSCs和ASCs等成體干細胞，DFAT細胞來源更為豐富。雷華等的研究表明，每300 mL脂肪組織可獲得2×108?6×108個 ASCs細胞[16]。而陳曉煒等在實驗中發(fā)現(xiàn)，只要有20 mL左右的脂肪組織就能獲得大量的成熟脂肪細胞，并且這些成熟脂肪細胞中的絕大多數(shù)都可以通過去分化過程轉變?yōu)镈FAT細胞[17]。2) 取材容易，且對人體損傷小。通過臨床上廣泛使用的脂肪抽吸術即可獲得大量的成熟脂肪細胞。不但可反復取材，而且對供者的生理和心理傷害小。3) DFAT細胞的獲取對供者年齡要求低。研究發(fā)現(xiàn)，即使從超過70歲的供者脂肪組織中都可獲得具有多向分化能力的DFAT細胞，這說明DFAT細胞可廣泛應用于各年齡段患者的自體細胞移植[12]。4) 細胞均一性高。BMSCs和ASCs在培養(yǎng)過程中，往往混有眾多其他類型的細胞。例如，原代培養(yǎng)的ASCs中含有眾多的平滑肌細胞 (18.6%)、淋巴細胞 (12.8%)、單核細胞 (13.3%)和內皮細胞 (2.7%)，而 DFAT細胞由高度均一的成熟脂肪細胞去分化而來，在原代培養(yǎng)時摻雜很少的其他細胞，其純度可高達98.7%左右。這樣的細胞用于干細胞移植治療和組織工程，不僅提高了臨床治療效率，也增加了臨床治療的安全性[12,18]。5)增殖能力強，成脂、成骨能力高。研究表明，從不足100 mL的脂肪組織中就可擴增培養(yǎng)出用于臨床治療的足量 DFAT細胞[12]。此外，DFAT細胞的成脂、成骨能力均高于ASCs細胞[9,14]。6)低免疫原性。Matsumoto等研究發(fā)現(xiàn)，與BMSCs、ASCs類似，DFAT細胞只表達HLA-ABC，不表達HLA-DR[12]。Poloni等的研究顯示，DFAT細胞可抑制淋巴細胞增殖，具有體外免疫調節(jié)能力[19]。這些研究表明 DFAT細胞有希望成為一種應用于同種異體干細胞移植和組織工程的理想細胞來源。

2 DFAT細胞的免疫學性質

深入了解 DFAT細胞的免疫學性質對其臨床應用具有重大的理論指導意義。目前，國內外有關 DFAT細胞的免疫學性質研究還鮮有報道，僅有的幾項研究只限于體外免疫學性質的探索。Matsumoto等對DFAT細胞的表面抗原表型進行了鑒定。他們發(fā)現(xiàn) DFAT細胞表達HLA-ABC，而不表達HLA-DR[12]。HLA-DR分子是誘發(fā)異體免疫排斥的主要抗原，而 DFAT細胞是 HLA-DR-細胞，暗示其具有較弱的免疫原性。Poloni等研究了成熟脂肪細胞在去分化過程中的免疫調節(jié)能力，并探索了它對共培養(yǎng)的同種異體來源的淋巴細胞的影響。結果發(fā)現(xiàn)，在與淋巴細胞的體外接觸共培養(yǎng)實驗中，成熟的脂肪細胞促進了淋巴細胞的增殖，而 DFAT細胞則抑制了活化的淋巴細胞增殖[19]。這些發(fā)現(xiàn)提示 DFAT細胞具有低免疫原性和體外免疫調節(jié)能力，其在同種異體干細胞移植和組織工程中可能具有較大應用潛力。

3 DFAT細胞的體內外多向分化能力及其臨床應用潛力

近年來，國內外的研究人員對 DFAT細胞的體內外多向分化能力作了較為廣泛和深入的探討，并開展了部分臨床前動物實驗以研究DFAT細胞的臨床應用潛力。研究發(fā)現(xiàn)，與BMSCs和ASCs類似，DFAT細胞也具有體內外成脂、成軟骨、成骨、成肌、成內皮、成神經(jīng)等多向分化能力，并在治療骨缺損、神經(jīng)性疾病、局部缺血性心臟病及腎臟疾病等方面均具有應用前景[12-13,20-21]。但是，目前尚無DFAT細胞應用于臨床的報道。

3.1 成脂分化及其應用潛力

Matsunoto等研究發(fā)現(xiàn)，DFAT細胞經(jīng)體外成脂誘導 3周后，其 LPL、瘦素、葡萄糖轉運蛋白 4等脂肪細胞表型分子以及 PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ和 FGF10等成脂分化表型分子的表達均上調[12]。多項研究表明，DFAT細胞經(jīng)體外成脂誘導 2–3周后，細胞內可觀察到明顯脂滴[12-14,22]。此外，動物實驗也顯示了DFAT細胞具有體內成脂分化能力。研究人員將DFAT細胞懸液注射入小鼠胸骨前部皮下，3周后發(fā)現(xiàn)有頰脂墊形成[23-24]。這些研究充分說明了DFAT細胞在體內外均具有成脂分化能力。

軟組織缺損修復是整形外科關注的焦點問題之一，傳統(tǒng)軟組織重建方法存在著供皮區(qū)缺損、植入物移動和吸收以及產(chǎn)生異物反應等缺陷。近年來，工程化脂肪組織構建技術的發(fā)展為軟組織缺損修復提供了新的治療思路。目前，工程化脂肪組織構建中常用的種子細胞是ASCs。研究發(fā)現(xiàn)，相比于ASCs，DFAT細胞具有更高的細胞均一度，增殖能力及成脂分化能力[9,12]。這提示DFAT細胞在體內構建工程化脂肪組織中具有較大的潛能和優(yōu)勢，其有望成為優(yōu)秀的脂肪組織工程種子。

3.2 成骨和成軟骨分化及其應用潛力

Matsumoto等研究發(fā)現(xiàn)，DFAT細胞在體外成骨誘導培養(yǎng)過程中，Run2、骨橋蛋白、骨鈣素等分子的表達逐漸加強，并且茜素紅染色結果呈陽性；DFAT細胞在成軟骨誘導培養(yǎng)過程中，SOX9、蛋白聚糖等軟骨細胞表型分子的表達有所增強，并且阿爾新藍染色及免疫組化分析結果皆為陽性[12]。Nakamura等則研究發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白 9 (BMP-9)和他克莫司(FK506)的共同刺激顯著地誘導了 DFAT細胞向成骨細胞的分化[25]。這些結果表明 DFAT細胞具有體外成骨和成軟骨分化能力。此外，以膠原支架為載體的 DFAT細胞移植也證明其具有體內成骨和成軟骨分化能力[12,24,26]。

目前臨床上嚴重創(chuàng)傷、腫瘤切除、骨感染、骨壞死等原因導致的的骨缺損、骨不愈合以及人工假體置換及翻修、脊柱、關節(jié)融合等十分常見，在自體和異體骨越來越不能滿足臨床需要的情況下，以支架+細胞+細胞因子模式的組織工程化骨逐步顯示出其優(yōu)勢并成為目前應用和研發(fā)的重點。目前組織工程化骨常用的種子細胞為MSCs，研究發(fā)現(xiàn)DFAT細胞不僅在來源上較 MSCs具有優(yōu)勢，其在工程材料支架上的生長速度、成骨能力以及 Runx2等骨細胞特異轉入因子表達水平均強于 MSCs細胞[27]。這些結果提示DFAT細胞有望替代MSCs細胞成為骨組織工程新的種子細胞，并為臨床上治療骨質疏松癥、骨不愈合及骨缺損等骨科疾病提供新思路。

3.3 成內皮分化及其應用潛力

Shen等經(jīng)預實驗發(fā)現(xiàn)，無論誘導與否，DFAT細胞均不表達內皮細胞或內皮祖細胞的標記物，如血管性血友病因子 (vWF)、CD31和CD34[13]。Matsumoto等也得到相同的研究結果[12]。然而，Planat-Bénard等卻發(fā)現(xiàn)，在含有甲基纖維素的培養(yǎng)基中，DFAT細胞能高表達vWF，并且呈分支狀排列[28]。有趣的是，Shen等還在研究中發(fā)現(xiàn)，將DFAT細胞接種至基質膠中可以形成許多管腔樣結構并且在管腔內存在紅細胞。此外，Jumabay等在使用DFAT細胞治療急性心肌梗塞小鼠的實驗中發(fā)現(xiàn)，DFAT細胞可能參與心肌新生血管的形成[29]。這些研究暗示DFAT細胞具有體內外成內皮分化能力，并且可以形成功能性血管。

近年來，組織工程化血管構建逐漸發(fā)展成為血管外科研究的新方向，并有望解決臨床上治療血管狹窄或閉塞導致的缺血性疾病自體血管移植及血管來源有限的問題?？紤]到 DFAT細胞具有來源豐富、增殖能力強、免疫原性低及可形成功能性血管等優(yōu)勢[12,29]，其在血管組織工程中可能是一個理想的種子細胞來源，并有望應用于血管再生和心血管疾病治療。

3.4 成肌分化及其應用潛力

根據(jù)細胞學特性和生物學行為的不同，肌細胞可以分為骨骼肌、心肌、平滑肌細胞 3種類型。MyoD是在干細胞成肌分化中起著重要作用的肌細胞特異性轉錄調控因子。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)加有5-氮雜胞苷的誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)后，DFAT細胞表達MyoD和成肌素，這表明DFAT細胞在體外可分化為骨骼肌細胞[30]。另有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)天然的心肌細胞培養(yǎng)基或干細胞甲基纖維素培養(yǎng)基培養(yǎng)后，DFAT細胞可在體外分化為心肌細胞[26]。此外，國外研究人員還開展了動物實驗以探究 DFAT細胞的體內成肌分化能力。Obinata等發(fā)現(xiàn)，在尿道擴張的小鼠中注射綠色熒光標記的DFAT細胞后，可觀察到成平滑肌樣的標記細胞，并且小鼠的尿道括約肌收縮性得到了改善[31]。Sakuma等的研究也有類似發(fā)現(xiàn)[32]。在Kikuta等將DFAT細胞移植到患有急性心肌梗塞的小鼠后，DFAT細胞轉變成了心肌樣細胞并且修復了梗塞的心臟組織[26]。上述研究表明，在適當?shù)臈l件下，DFAT細胞具有體內外成肌分化能力，提示其在治療局部缺血性心臟病、腎臟疾病等方面具有應用前景。

3.5 成神經(jīng)分化及其應用潛力

Ohta等研究發(fā)現(xiàn)，DFAT細胞表達一些神經(jīng)性的標記物，如巢蛋白、β微管蛋白和膠質纖維酸性蛋白，而將同種異體來源的 DFAT細胞移植到因脊髓損傷導致運動功能障礙的大鼠中，可以觀察到大鼠的后肢運動功能得到了明顯恢復。此外，他們還在注射部位檢測到了移植細胞，其中有部分細胞表達 β微管蛋白[33]。這些發(fā)現(xiàn)表明，DFAT細胞具有體內外成神經(jīng)分化能力，提示其在治療神經(jīng)性疾病方面具有應用前景。

4 問題與展望

DFAT細胞有著來源廣泛、取材容易、對供者年齡要求低、均一性高、增殖和成脂分化能力強及免疫原性低等臨床應用優(yōu)勢，并且具有與ASCs類似的細胞表面抗原標記、體外免疫調節(jié)能力以及體內外成脂、成軟骨、成骨、成肌、成神經(jīng)等多向分化能力。這些發(fā)現(xiàn)提示 DFAT細胞在治療骨缺損、神經(jīng)性疾病、局部缺血性心臟病、腎臟疾病等方面具有廣泛的應用前景。

然而 DFAT細胞體外培養(yǎng)擴增技術有待提高，體內生物學行為不明確等問題阻礙了其在臨床上的應用。首先，DFAT細胞來源的成熟脂肪細胞中會不會摻雜了 ASCs等增殖能力較強的細胞，ASCs等細胞的污染又會產(chǎn)生多大的影響；其次，在當前的培養(yǎng)方法下，DFAT細胞的培養(yǎng)周期較長且消耗的培養(yǎng)基過多，如何改善其培養(yǎng)方法來避免這些問題？此外，國內外研究人員對 DFAT細胞開展的研究還多局限于細胞生物學特性、體外免疫學性質等方面，而有關 DFAT細胞臨床前動物實驗的研究范圍和深度還比較有限。對于這些問題，相關研究人員應給予足夠的重視，就此進一步深入地開展相關實驗研究對促進 DFAT細胞在干細胞移植和組織工程中應用具有重要意義。

[1]Chalmers DRC, Rathjen PD, Rathjen J, et al. Stem cells and regenerative medicine: From research to clinical applications. J Law Med, 2013, 20(4):831–844.

[2]Balmayor ER, van Griensven M. Stem Cell Therapy for Bone Disorders. Mesenchymal Stem Cell Therapy. Clifton: Humana Press, 2013: 101–116.

[3]Mizuno H. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine in the field of plastic and reconstructive surgery. J Oral Biosci, 2013, 55(3):132–136.

[4]English K, Mahon BP, Wood KJ. Mesenchymal stromal cells; role in tissue repair, drug discovery and immune modulation. Curr Drug Deliv, 2013,(Epub ahead of print).

[5]Wall A, Board T. Mesenchymal stem cells//Classic Papers in Orthopaedics. London: Springer, 2014:445–448.

[6]Baer PC, Geiger H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization,characterization, and heterogeneity. Stem Cells Int,2012, 2012: 812693.

[7]Battula VL, Bareiss PM, Treml S, et al. Human placenta and bone marrow derived MSC cultured in serum-free, b-FGF-containing medium express cell surface frizzled-9 and SSEA-4 and give rise to multilineage differentiation. Differentiation, 2007,75(4): 279–291.

[8]Rebelatto CK, Aguiar AM, Moret?o MP, et al.Dissimilar differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, and adipose tissue. Exp Biol Med (Maywood), 2008,233(7): 901–913.

[9]Liao YJ, Gao JH, Lu F. Comparative study on potential of adipogenic differentiation between dedifferentiated adipocytes and adipose-derived stromal cells. Chin J Repara Reconstr Surg, 2010,24(6): 749–753 (in Chinese).廖云君, 高建華, 魯峰. 去分化脂肪細胞與脂肪來源干細胞成脂分化能力的比較研究. 中國修復重建外科雜志, 2010, 24(6): 749–753.

[10]Shi LL, Yang XQ. Differentiation potential and application of stem cells from adipose tissue. Chin J Repara Reconstr Surg, 2012, 26(8): 1007–1011 (in Chinese).史琳麗, 楊向群. 脂肪組織來源干細胞的分化潛能和應用. 中國修復重建外科雜志, 2012, 26(8):1007–1011.

[11]Wei S, Du M, Jiang Z, et al. Bovine dedifferentiated adipose tissue (DFAT)cells: DFAT cell isolation.Adipocyte, 2013, 2(3): 148–159.

[12]Matsumoto T, Kano K, Kondo D, et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol, 2008, 215(3):210–222.

[13]Shen J, Sugawara A, Yamashita J, et al.Dedifferentiated fat cells: an alternative source of adult multipotent cells from the adipose tissues. Int J Oral Sci, 2011, 3: 117–124.

[14]Kishimoto N, Momota Y, Hashimoto Y, et al. The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig, 2013: 1–9.

[15]Wei S, Zan L, Hausman GJ, et al. Dedifferentiated adipocyte-derived progeny cells (DFAT cells):potential stem cells of adipose tissue. Adipocyte,2013, 2(3): 1–6.

[16]Lei H, Li QF. Progress in adipose-derived stem cells.Chin J Plast Surg, 2003, 19(6): 465–466 (in Chinese).雷華, 李青峰. 脂肪干細胞的研究進展. 中華整形外科雜志, 2003, 19(6): 465–466.

[17]Chen XW, Jiang P, Gao JH, et al. Experimental study of human adipocyte dedifferentiation for adipose tissue engineering. J South Med Univ, 2009,29(4): 606–610 (in Chinese).陳曉煒, 姜平, 高建華, 等. 脂肪細胞去分化及構建組織工程化脂肪的實驗研究. 南方醫(yī)科大學學報, 2009, 29(4): 606–610.

[18]Song ZY, Shi XE, Yang H, et al. Analysis of expression patterns of key genes during the pig (Sus scrofa)mature adipocyte dedifferentiation based on a novel ceiling culture model. J Agric Biotechnol,2013, 21(4): 379–387 (in Chinese).宋子儀, 史新娥, 楊浩, 等. 基于一種新的天花板培養(yǎng)方法分析豬成熟脂肪細胞去分化過程中關鍵基因表達模式. 農業(yè)生物技術學報, 2013, 21(4):379–387.

[19]Poloni A, Maurizi G, Leoni P, et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells.Stem Cells, 2012, 30(5): 965–974.

[20]Kono S, Kazama T, Kano K, et al. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet J, 2014,199(1): 88–96.

[21]Sugawara A, Sato S. Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration. Human Cell, 2013: 1–10.

[22]Cheng FF, Wei C, Pan WW, et al. Biocharacteristics′study of dedifferentiated fat cells. Chin J Aesth Plast Surg, 2012, 23(12): 760–763 (in Chinese).程飛飛, 魏翠, 潘文雯, 等. 去分化脂肪細胞的生物學特性探究. 中國整形美容外科雜志, 2012,23(12): 760–763.

[23]Jumabay M, Zhang R, Yao Y, et al. Spontaneously beating cardiomyocytes derived from white mature adipocytes. Cardiovas Res, 2010, 85(1): 17–27.

[24]Oki Y, Watanabe S, Endo T, et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells can trans-differentiate into osteoblasts in vitro and in vivo only by all-trans retinoic acid. Cell Struct Funct,2008, 33: 211–222.

[25]Nakamura T, Shinohara Y, Momozaki S, et al.Co-stimulation with bone morphogenetic protein-9 and FK506 induces remarkable osteoblastic differentiation in rat dedifferentiated fat cells. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 440(2): 289–294.

[26]Kikuta S, Tanaka N, Kazama T, et al. Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomyinduced osteoporosis. Tissue Engineering Part A,2013, 19(15/16): 1792–1802.

[27]Sakamoto F, Hashimoto Y, Kishimoto N, et al. The utility of human dedifferentiated fat cells in bone tissue engineering in vitro. Cytotechnology, 2013:1–10.

[28]Planat-Bénard V, Silvestre JS, Cousin B, et al.Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation, 2004, 109(5): 656–663.

[29]Jumabay M, Matsumoto T, Yokoyama S, et al.Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats.J Mol Cell Cardiol, 2009, 47(5): 565–575.

[30]Kazama T, Fujie M, Endo T, et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells can transdifferentiate into skeletal myocytes in vitro.Biochem Biophys Res Commun, 2008, 377:780–785.

[31]Obinata D, Matsumoto T, Ikado Y, et al.Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT)cells improves urethral sphincter contractility in a rat model. Int J Urol,2011, 18(12): 827–834.

[32]Sakuma T, Matsumoto T, Kano K, et al. Mature,adipocyte derived, dedifferentiated fat cells can differentiate into smooth muscle-like cells and contribute to bladder tissue regeneration. J Urol,2009, 182: 355–365.

[33]Ohta Y, Takenaga M, Tokura Y, et al. Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells(DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant, 2008, 17(8): 877–886.