盛嘉元，張緒，鄭強，徐志南

浙江大學化學工程與生物工程學系，浙江 杭州 310027

無細胞蛋白合成體系作為一種快速、高效的體外合成蛋白手段，通過在細胞抽提物的酶系中補充轉(zhuǎn)錄與翻譯所需各類底物和能量物質(zhì)從而完成目標蛋白的合成。與傳統(tǒng)基于活細胞的體內(nèi)表達系統(tǒng)相比，無細胞蛋白合成體系具有多種優(yōu)點，如無膜阻隔、基因和聚合酶濃度可控性、報告物易量化測量、能直接以PCR產(chǎn)物為模板，以及具有高通量性等等。自從Nirenberg和Matthaei 1961年利用無細胞系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了密碼子以來[1]，無細胞蛋白表達系統(tǒng)快速高效合成具有生物活性蛋白的特質(zhì)驅(qū)使其不斷發(fā)展，已成為生物科學基礎(chǔ)研究及應(yīng)用研究中的重要工具[2-3]。近年來各種常規(guī)胞內(nèi)手段難以表達的蛋白得以在體外無細胞中順利表達[4-6]，并發(fā)掘其高通量應(yīng)用潛力建立起多種蛋白質(zhì)文庫[7]用于蛋白進化[8]和結(jié)構(gòu)基因組學方面的研究[9]。早期無細胞系統(tǒng)存在多種缺點，如反應(yīng)持續(xù)時間短，產(chǎn)率低，必須補充價格昂貴的能量物質(zhì)與底物，反應(yīng)體系體積小等。而且，反應(yīng)體系內(nèi)部一直如黑匣子一般沒有得到充分研究[2,10]。近十年來這些問題逐步得到解決，已經(jīng)構(gòu)建成功反應(yīng)體積達100 L的無細胞蛋白表達體系，標志著其逐漸開始展現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用前景[11]。

目前重組蛋白藥物已經(jīng)在全球藥物市場上占有非常重要的地位。在2007年6 000億美元的制藥產(chǎn)業(yè)中占有 1/6的份額，每年還以7%?15%的速度在增長[12]。通常天然蛋白可能會由于水溶性差，易被蛋白酶降解，半衰期短，化學穩(wěn)定性差等各種因素導致只有極少一部分能直接應(yīng)用于醫(yī)療目的。能夠穩(wěn)定地表達和純化出達到藥用指標的重組蛋白是生物制藥業(yè)的主要目標。重組蛋白藥物的生物學功能與其肽鏈折疊與修飾方式高度相關(guān)，這決定了重組蛋白藥物遠高于小分子化學藥的研發(fā)難度。因此，在生物前制藥工業(yè)中不僅需要繼續(xù)完善已有的大腸桿菌、酵母和CHO等表達系統(tǒng)，也必須發(fā)展更為靈活高效的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)新技術(shù)。此外，人類基因組序列及生物信息學數(shù)據(jù)表明，人類還有成千上萬的蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)未被了解，其中相當一部分具有醫(yī)療方面的潛力。在研發(fā)人類治療蛋白過程中需要制備大量高質(zhì)量的蛋白，用于蛋白結(jié)構(gòu)、功能和藥效學等研究，而常規(guī)體內(nèi)表達系統(tǒng)難以滿足這一不斷增長需求。無細胞蛋白表達系統(tǒng)高效快捷和高通量特性可以為這些制約生物制藥業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問題提供新的解決方法。

本文結(jié)合已經(jīng)開展的無細胞合成多種蛋白質(zhì)的研究成果，總結(jié)無細胞蛋白表達體系的最新研究進展，對該系統(tǒng)在生物制藥科學前沿領(lǐng)域發(fā)展方向上的應(yīng)用潛力進行了重點討論。

1 無細胞蛋白表達體系研究進展

從事無細胞蛋白表達研究或以之作為工具的研究人員都會面臨無細胞蛋白表達系統(tǒng)的種類選擇，表達條件優(yōu)化，蛋白功能構(gòu)象，以及表達規(guī)模一系列問題。本文總結(jié)了近年來無細胞蛋白表達體系的進展，為后續(xù)研究工作開展提供參考。

1.1 不同物種無細胞體系的比較

一個完整的無細胞蛋白表達系統(tǒng)必須包含轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白折疊和能量代謝模塊 (例如：核糖體、氨酰-tRNA合成酶、翻譯起始、延伸因子、核糖體釋放因子、分子伴侶等)。細胞抽提物在底物供應(yīng)充足的條件下如一個小型細胞工廠生產(chǎn)并折疊蛋白質(zhì)，直至底物耗盡 (如ATP、半胱氨酸等)或副產(chǎn)物 (如無機磷 Pi)積累到一定濃度抑制反應(yīng)繼續(xù)進行。理論上所有來源于微生物、植物或動物細胞的抽提物，都能滿足蛋白表達的基本需求，具有構(gòu)建無細胞蛋白表達系統(tǒng)的潛力。但是不同物種來源的無細胞系統(tǒng)的表現(xiàn)差異巨大。因此對象的選擇成為構(gòu)建系統(tǒng)的首要考慮因素。

我們除了考慮物種對象，還必須考慮原料的供應(yīng)、制備過程的難易程度、蛋白產(chǎn)量、蛋白的復雜度、下游處理簡易程度和成本高低等問題。到目前為止已經(jīng)商業(yè)化的無細胞蛋白表達系統(tǒng)有大腸桿菌系統(tǒng) (E. coli extract，ECE)、兔網(wǎng)織紅細胞 (Rabbit reticulocyte lysate，RRL)、麥胚 (Wheat germ extract, WGE)、昆蟲 (Insect cell extract, ICE)和人源系統(tǒng)。除此以外還有鏈霉菌 Streptomycetaceae[13]、利什曼錐蟲Leishmania tarentolae[14]、爪蟾卵母細胞Xenopus laevis[15]、擬南芥Arabidopsis thaliana[16]等系統(tǒng)報道構(gòu)建成功。表 1中對常見的商業(yè)化系統(tǒng)作了比較。大腸桿菌系統(tǒng)由于其價格低、制備易、表達量高三大優(yōu)點成為目前為止最受歡迎和普遍使用的系統(tǒng)。并在其基礎(chǔ)上構(gòu)建了只包含最基本轉(zhuǎn)錄翻譯功能的 PURE系統(tǒng)，大大降低了研究的遺傳背景[17]。

相對于原核系統(tǒng)，大多數(shù)種類真核細胞的培養(yǎng)難度大，花費更高，其細胞抽提物的制備過程更為繁瑣，但是它們具有一些可以表達復雜蛋白以及實現(xiàn)翻譯后修飾等優(yōu)勢[18]。真核系統(tǒng)中WGE、RRL和ICE系統(tǒng)最為常見。WGE是用小麥胚芽制備而成[19-20]，在真核系統(tǒng)中產(chǎn)量最高，但是其仍舊缺乏糖基化等翻譯后修飾手段。RRL和ICE系統(tǒng)具有異戊二烯化[21-22]、乙?；痆23-24]、磷酸化[25]、信號肽處理[26]和核糖基化等翻譯后修飾手段。RRL系統(tǒng)在進行翻譯后修飾時需要額外添加分離純化的微體(Microsome)，其蛋白產(chǎn)量只有數(shù)十微克/毫升[27-28]。ICE系統(tǒng)通常用草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda細胞制備，產(chǎn)量也為數(shù)十微克/毫升蛋白[29-30]。除了以上常見無細胞系統(tǒng)，酵母系統(tǒng)、癌細胞、雜交瘤細胞也見諸報道。Zárate等在2010年嘗試將原核系統(tǒng)的高表達量的優(yōu)勢與真核系統(tǒng)折疊效率高的優(yōu)勢結(jié)合在一起，構(gòu)建了一種新型的大腸桿菌與麥胚的雜合無細胞系統(tǒng)[31]，能夠在較高蛋白表達基礎(chǔ)上實現(xiàn)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。各種無細胞體系的出現(xiàn)使得研究人員可以較為靈活地根據(jù)不同的實驗?zāi)繕诉x擇合適的無細胞表達系統(tǒng)。

表1 無細胞蛋白表達系統(tǒng)比較Table 1 Comparison of various cell-free protein synthesis systems

1.2 無細胞蛋白表達技術(shù)關(guān)鍵突破

無細胞蛋白表達技術(shù)的進步主要歸結(jié)于 3方面的突破：合適的底物供應(yīng)、平衡穩(wěn)定的反應(yīng)環(huán)境、抑制性副產(chǎn)物的去除。不難發(fā)現(xiàn)所有這些突破點都與一個處于快速生長期的細胞所擁有的特點高度一致[32-33]。

圖1 無細胞系統(tǒng)中能量供應(yīng)方式 (A：以高能磷酸化合物直接供能；B：氧化磷酸化途徑供能；C：利用中心代謝網(wǎng)絡(luò)供能)[40]Fig. 1 Energy supplement of the cell-free protein expression system[40]. (A)Costly one-step phosphorylation reactions driven by PEP, CP or AcP. (B)Energy supply through oxidative phosphorylation. (C)Energy supply through activated central metabolism.

Kim和Swartz通過一系列研究表明在無細胞體系中并不是只有磷酸化反應(yīng)為蛋白合成提供能量 (圖1A, B)，抽提物中依然有代謝網(wǎng)絡(luò)影響整個表達過程[34-36]。無細胞體系不再是一個“黑匣子”，其中的代謝途徑得以了解 (圖1C)。他們的工作使得無細胞系統(tǒng)的構(gòu)建工作有新的思路，研究人員認識到細胞質(zhì)環(huán)境的模擬對于高效的體外表達系統(tǒng)至關(guān)重要。最近幾年來，通過對細胞抽提物制備方法的改進，使得抽提物更加穩(wěn)定，并充分利用其本身代謝網(wǎng)絡(luò)來為無細胞系統(tǒng)提供能量。Tarui等通過激活中心代謝網(wǎng)絡(luò)與利用氧化磷酸化途徑，制備的無細胞體系在2 h內(nèi)蛋白表達量可達到1.2 mg/mL[30]。Calhoun和 Swartz等證明添加葡萄糖也能夠為無細胞蛋白表達系統(tǒng)提供能量，并用單磷酸核苷替代體系中的三磷酸核苷，大幅降低了無細胞的制備成本[37-40]。Wang等利用麥芽糖糊精、可溶性淀粉、糖原等代謝較為緩慢的物質(zhì)作為能源底物，大大穩(wěn)定了反應(yīng)體系的pH環(huán)境和無機磷的濃度[41]。最近Caschera在無細胞體系中添加麥芽糖，使其體系能夠重新利用無機磷，減少副產(chǎn)物對反應(yīng)的抑制作用，成功將批次反應(yīng)的時間延長到10 h，目標蛋白產(chǎn)量高達2.3 mg/mL[42]。此外，通過敲除導致氨基酸降解的酶也能夠進一步提高蛋白合成的效率[43]。

最初Nirenberg等用于蛋白預(yù)測性研究的無細胞反應(yīng)屬于批次式 (Batch)無細胞反應(yīng)[1]。在這種反應(yīng)模式下，維持無細胞反應(yīng)正常進行的底物與能量物質(zhì)在反應(yīng)中消耗迅速而得不到補充，因而反應(yīng)持續(xù)時間很短，蛋白產(chǎn)率往往只有數(shù) μg/mL，嚴重阻礙了無細胞蛋白表達技術(shù)的應(yīng)用與推廣。為了克服批次式反應(yīng)模式的缺點，Spirin等在1988年提出了一種更高效的無細胞反應(yīng)模式：連續(xù)交換式無細胞反應(yīng)(Continuous exchange cell-free, CECF)[44]。CECF的反應(yīng)體系由負責表達目標蛋白的反應(yīng)模塊(Reaction buffer)與負責為無細胞反應(yīng)補充消耗的能量和底物補充模塊 (Feeding buffer)組成。反應(yīng)模塊與補充模塊之間由一層具有選擇透過性的半透膜分隔開。通過分子擴散作用 (濃度差)，補充模塊中的高濃度的能量和底物小分子透過半透膜進入反應(yīng)模塊，源源不斷地為無細胞反應(yīng)提供能量與底物，維持反應(yīng)體系的正常運行；另一方面，反應(yīng)模塊中堆積的無機磷等小分子副產(chǎn)物也能夠透過半透膜擴散到補充模塊，從而降低了副產(chǎn)物對無細胞反應(yīng)的抑制作用，保證了反應(yīng)的順利進行，表達的目標蛋白在反應(yīng)模塊中不斷積累。采用高效的 CECF體系，表達水平一般可以達到3?6 mg/mL。

雖然 CECF系統(tǒng)可以提高單位體積內(nèi)的蛋白表達量，但是其反應(yīng)需要約十倍于反應(yīng)體積的含有氨基酸、NTP等物質(zhì)的補充溶液，反應(yīng)時間長達10 h以上。因此，該模式較低的單位時間產(chǎn)率以及高昂的單位產(chǎn)量成本，并不是常規(guī)無細胞表達手段的首選方式，僅在進行蛋白結(jié)晶、蛋白結(jié)構(gòu)測定等研究領(lǐng)域選擇 CECF模式進行目標蛋白的高濃度表達。目前報道研究大多集中在采用葡萄糖、麥芽糖等廉價能源物質(zhì)來穩(wěn)定反應(yīng)體系的化學環(huán)境，盡可能回收利用無機磷，不斷提高Batch模式的反應(yīng)效率。

在這些基礎(chǔ)上，Sutro生物制藥公司構(gòu)建了經(jīng)濟的E. coli大體積無細胞系統(tǒng)，在100 L的反應(yīng)體積下，10 h之內(nèi)得到了700 mg/L的重組人細胞因子 (rhGM-CSF)[11]。該結(jié)果為今后利用無細胞蛋白表達系統(tǒng)來商業(yè)化生產(chǎn)對細胞有毒性的蛋白以及其他難以表達的蛋白奠定了基礎(chǔ)。

1.3 無細胞體外表達蛋白的折疊

蛋白要行使功能就需要有正確的構(gòu)象，體外表達含有二硫鍵等復雜結(jié)構(gòu)的蛋白數(shù)十年來都一直是研究焦點。蛋白的正確折疊需要將目標蛋白的各個疏水區(qū)域進行保護使其互不影響，提供合適的化學環(huán)境，還需要加入鐵硫簇等輔助因子來幫助二硫鍵的形成以及促進二硫鍵的異構(gòu)化。長期的自然進化使得生物在細胞內(nèi)在不同區(qū)域來分別進行蛋白合成與氧化折疊，而無細胞體系需要在同一反應(yīng)空間中同時完成兩項任務(wù)。Swartz課題組首先用碘乙酰胺(Iodoacetamide, IAM)處理細胞抽提物，然后用谷胱甘肽緩沖液來提供氧化環(huán)境，再利用DsbC來催化二硫鍵的形成，以此模擬體內(nèi)的氧化折疊途徑成功合成了有活性的尿激酶以及組織纖溶酶原激活物片段[45-46]。

生物體內(nèi)還有分子伴侶這一類蛋白因子來幫助新生多肽鏈保持正確的構(gòu)象，避免蛋白聚集影響其生物活性。Katzen等在無細胞體系中直接加入分子伴侶就成功表達了復雜蛋白[47]。除了簡單地直接加入分子伴侶，Welsh等還通過將真核來源的Hsp70分子伴侶BiP與觸發(fā)因子(一類核糖體相關(guān)的E. coli分子伴侶)共表達來模擬細胞內(nèi)膜上分子伴侶協(xié)助的蛋白折疊過程[48]，這一方法提高了分泌性真核蛋白的可溶性表達。Sasaki通過加入兩性多糖納米凝膠在無細胞體系中來幫助蛋白折疊，該凝膠可以結(jié)合并控制多肽鏈的釋放從而避免了蛋白過快表達導致的聚集沉淀和錯誤折疊[49]。影響蛋白折疊的因素非常廣泛，在無細胞中幫助蛋白的正確折疊的本質(zhì)手段就是要盡量模擬蛋白在胞內(nèi)表達的真實環(huán)境。目前并沒有一種手段可以解決所有問題，需要根據(jù)目標產(chǎn)物的特點，采取相應(yīng)的調(diào)控反應(yīng)環(huán)境方法，幫助蛋白質(zhì)在無細胞中正確折疊，提高生物活性。

2 無細胞蛋白表達系統(tǒng)在生物制藥中的應(yīng)用

國際藥物研發(fā)中，新藥研發(fā)難度越來越大，原研生物藥研發(fā)數(shù)量下降明顯。近10年再未出現(xiàn)對市場有較大影響的全新產(chǎn)品類別，解決這些問題需要在人類基因組上有進一步突破。在越來越難的原研生物藥研發(fā)中，單抗和疫苗占據(jù)研發(fā)主體，重組蛋白研發(fā)比例較低且更多關(guān)注產(chǎn)品的改性升級。無細胞蛋白表達技術(shù)在生物制藥業(yè)上游研發(fā)與下游藥物生產(chǎn)兩方面遇到瓶頸時都顯示出很大的發(fā)展應(yīng)用潛力。

2.1 在蛋白表達時加入非天然氨基酸

蛋白進行工程改性的重要手段之一是在蛋白序列中引入非天然氨基酸來提供額外的基團以便對蛋白質(zhì)進行化學修飾。Cho等將非天然的p-乙酰苯丙氨酸 (pAcF)引入人生長因子 (hGH)中的特定位點，使其可以和聚乙二醇實現(xiàn)共價結(jié)合[50]。同樣將β干擾素中蛋氨酸替換成非天然類似物并對其特定位點進行PEG修飾，得到的產(chǎn)物在治療多發(fā)性硬化癥時給藥方式更加簡便，顯示出極高的耐受性。Zimmerman等從詹氏甲烷球菌Methanococcus jannaschii中找到一種高 pAMF(非天然酪氨酸)親和性的酪氨酰-tRNA合成酶從而實現(xiàn)將其插入到曲妥珠單抗 (Trastuzumab)的指定位置。通過點擊化學的方法將 DBCO-PEGMMAF (DBCO-PEG-monomethyl auristatin)在pAMF處與單抗結(jié)合到一起，形成了新型的靶向抗腫瘤藥物[51]。目前全新領(lǐng)域的重組蛋白藥物研發(fā)越來越難，目前的重磅藥物基本都是基于蛋白藥物升級，基本要經(jīng)歷蛋白修飾(速效、長效、給藥方式升級)這一過程，而無細胞技術(shù)可以便捷可控地添加各種非天然氨基酸實現(xiàn)常規(guī)重組表達后難以解決的復雜修飾過程，日益顯示出在這方面的優(yōu)勢[52]。

2.2 類病毒顆粒的表達

類病毒顆粒 (Virus-like particles, VLPs)是一類大小在25–100 nm，由一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白自組裝成的復合體。由于其結(jié)構(gòu)上類似于病毒顆粒，能引起免疫應(yīng)答，但是VLPs不含有遺傳物質(zhì)，不能自我復制，可以成為一種安全的疫苗[53]。病毒的衣殼蛋白通常擁有天然的自組裝能力，能夠在原核系統(tǒng)或真核系統(tǒng)中組裝為一種空心結(jié)構(gòu)，在藥物傳遞以及作為基因治療方面引起研究人員的關(guān)注。要成功組裝成為VLPs有嚴格的條件，首先其亞組成單位結(jié)構(gòu)要高度一致；其次，其亞基比例要合適，純度要求高。胞內(nèi)系統(tǒng)由于難以大量產(chǎn)生結(jié)構(gòu)高度一致的亞基蛋白，以及純度低等限制性因素，因此直接合成亞病毒顆粒非常困難，而體外無細胞系統(tǒng)可以克服上述限制性因素。Bundy等利用無細胞系統(tǒng)成功表達了MS2外殼蛋白[54]。無細胞自身的一些特點更可以大大擴展VPLs的應(yīng)用范圍。比如Patel和Swartz在表達類病毒顆粒時摻入非天然氨基酸，表達的 VLPs可以用抗體片段、GM-CFS、DNA和聚乙二醇來進行修飾[55]。事實表明，這些VLPs根據(jù)其摻入非天然氨基酸的比例和位點，可以同時用多種手段對其進行修飾來提高VLPs的性能。Bundy和 Swartz還通過控制無細胞系統(tǒng)的氧化還原環(huán)境，調(diào)節(jié)衣殼蛋白單聚體的二硫鍵的表達從而提高了 VLPs的穩(wěn)定性[56]。這些研究不斷證明無細胞蛋白表達系統(tǒng)在利用 VLPs進行藥物傳遞和疫苗開發(fā)上有很高的應(yīng)用價值和潛力。

2.3 藥物靶標膜蛋白表達

哺乳動物基因組 30%都由膜蛋白組成，其中大概有一半都可以成為藥物靶標。因此需要對這些膜蛋白的結(jié)構(gòu)功能進行深入研究。目前膜蛋白的表達主要有以下障礙：首先，細菌的細胞磷脂膜組成結(jié)構(gòu)并不適于哺乳動物膜蛋白正確插入和折疊；其次，膜蛋白的體內(nèi)過量表達也會造成生物毒性和聚集沉淀；另外從哺乳動物細胞分離純化膜蛋白并整合進人工脂質(zhì)體也面臨非常大的挑戰(zhàn)。這些原因造成膜蛋白的重組表達和純化非常困難。無細胞體系為膜蛋白的表達純化提供了高效平臺，在開放性的體外表達體系中可以直接加入去污劑以及脂質(zhì)體，蛋白表達后可以直接整合進脂質(zhì)體或直接處于疏水環(huán)境中有效避免聚集，為后續(xù)分離純化和功能研究提供了很大便利。無細胞體系表達功能性膜蛋白主要有3種模式 (圖2)。

P-CF (Precipitate cell-free)模式：在標準無細胞反應(yīng)體系，大多數(shù)膜蛋白以沉淀的形式表達，這種沉淀可以用一些溫和的去垢劑重懸，得到膜蛋白-去污劑膠束溶液。但由于去垢劑結(jié)構(gòu)的差異，不同去垢劑對膜蛋白的重懸效率是明顯不同的。該策略的主要優(yōu)點就是用簡單的流程即可得到較高純度的可溶膜蛋白。

D-CF (Detergent-based cell-free)模式：直接在無細胞體系添加去垢劑，其形成的膠束提供膜蛋白正確折疊所需要的疏水環(huán)境，實現(xiàn)目標蛋白的體外可溶表達。無細胞體系表達膜蛋白常用去垢劑有烷基糖苷 (如 β-OG、DDM)、類固醇衍生物 (如 Digitonin)、聚氧乙烯烷基醚(如 Brij35、Brij58、Brij78、Brij98、Tween20、Tween80)、聚氧乙烯衍生物 (如Triton X-100)、長鏈磷脂酸甘油 (如LMPG、LPPG)以及單鏈/雙鏈磷脂酸膽堿 (如DHPC、DPC)等。雖然去垢劑已成功應(yīng)用于多種膜蛋白的功能性表達，但由于膜蛋白、去垢劑之間結(jié)構(gòu)的差異，不同膜蛋白所需要的去垢劑種類和濃度是不相同的。目前尚未發(fā)現(xiàn)對各種膜蛋白都普遍適用的去垢劑。而且去垢劑的添加并不能夠保證蛋白質(zhì)的正確折疊，所以用該策略制備得到的膜蛋白只有很少一部分的功能是得到表征。

圖2 無細胞膜蛋白表達模式 (P-CF模式：無疏水環(huán)境，膜蛋白以沉淀形式表達；D-CF模式：有去污劑提供疏水環(huán)境，蛋白以可溶形式表達；L-CF模式：膜蛋白表達后直接整合到脂質(zhì)體中)Fig. 2 Expression mode of CF production of membrane proteins. P-CF mode: no hydrophobic environments are provided, and the MPs precipitate after translation. D-CF mode: the synthesized MPs can stay soluble by insertion into the provided detergent micelles. L-CF mode: the synthesized MPs have the possibility to integrate into supplemented liposomes.

L-CF (Lipid-based cell-free)模式：由膜蛋白能夠自動定位于細胞膜的特點，直接在無細胞反應(yīng)體系添加磷脂雙分子層小球 (脂質(zhì)體)，同時實現(xiàn)膜蛋白合成、膜定位和穩(wěn)定構(gòu)象，可以提高功能性膜蛋白質(zhì)的表達效率。通過蔗糖梯度離心或親和層析純化即得到嵌有目的蛋白的脂質(zhì)體 (Proteoliposome)，可直接用于膜蛋白的功能重建檢測。

目前已有一大批膜蛋白在無細胞中得以成功表達。G蛋白偶聯(lián)受體是一類非常重要的膜蛋白藥物靶標，在E. coli體內(nèi)過量表達通常以包涵體的形式存在，在哺乳動物體內(nèi)則表達量非常低。Ishihara等在E. coli S30系統(tǒng)中成功表達了人 β2腎上腺素受體 (β2AR)，人 M2毒蕈堿乙酰膽堿受體 (M2)以及鼠神經(jīng)降壓素受體(NTR)，表達量在 150–200 μg/mL 之間[57]。Klammt等在CECF系統(tǒng)中表達豬2型加壓素受體 (V2R)表達量高達3 mg/mL[58]，在大腸桿菌無細胞體系中以沉淀形式高效表達了大腸桿菌多藥轉(zhuǎn)運蛋白EmrE、SugE、TehA和YfiK[59]。Goren等在麥胚系統(tǒng)中以L-CF模式表達硬脂酰CoA脫飽和酶時發(fā)現(xiàn)90%以上的蛋白成功整合到脂質(zhì)體中，當脫飽和酶與細胞色素B5共表達時，兩者可以同時整合到脂質(zhì)體中[60]。這些結(jié)果都顯示出無細胞體系表達膜蛋白對傳統(tǒng)表達方式的優(yōu)勢。

本實驗室利用無細胞表達系統(tǒng)成功表達出水通道蛋白AqpZ[61-63]，表達量高達900 μg/mL，在CECF體系中成功表達Aqp4并成功證明其功能[64]。利用大腸桿菌無細胞表達系統(tǒng)表達日本血吸蟲Schistosoma japonicum的腺苷轉(zhuǎn)運蛋白(sjANT)時表達量高達472 μg/mL，是之前報道最高表達量的25倍之多[65]。在無細胞體系中高效表達這些受體膜蛋白可以解決制約藥物受體研究中的瓶頸問題，研究工作者可以短時間內(nèi)就得到大量高純度蛋白進行結(jié)構(gòu)分析，或者高通量藥物篩選工作。

2.4 高通量無細胞技術(shù)

在后基因組時代，高通量蛋白表達技術(shù)顯得越來越重要。而無細胞蛋白表達系統(tǒng)其自身的許多特點使其非常利于構(gòu)建高通量系統(tǒng)。首先，該系統(tǒng)可以直接使用PCR片段為模板，從而避免多步繁瑣的基因克隆步驟；其次，已經(jīng)開發(fā)出來非常適合微量蛋白表達的高效系統(tǒng)(如在96或384孔板)；第三，有巨大的潛力利用微芯片技術(shù)實現(xiàn)自動化操作；最后，由于反應(yīng)體系沒有膜結(jié)構(gòu)的存在，反應(yīng)時可以隨時進行外界干預(yù)，如添加同位素標記的氨基酸等等。

Goshima等用WGE系統(tǒng)合成了13 364個人源蛋白，大多數(shù)蛋白被證明具有生物活性，99.86%的蛋白成功轉(zhuǎn)印到玻璃基片上構(gòu)建了蛋白微陣列芯片[7]。Yamamoto等設(shè)計了更為精密、復雜的可控溫的微流控無細胞反應(yīng)器[66]。這一基于PCR模板直接表達蛋白的技術(shù)省去了繁瑣的DNA克隆、蛋白純化步驟，結(jié)合機器人技術(shù)使得蛋白芯片制作分析過程可以節(jié)省更多人力物力并進一步提高分析的可控性與精確性。

除芯片或蛋白陣列以外，另外一種利用微囊或脂質(zhì)體包裹的無細胞體系構(gòu)建人工細胞方式的微體系也得到了很多發(fā)展，Shima等以蛋黃磷脂酰膽堿、膽固醇以及聚乙二醇為原料制備脂質(zhì)體在其中包裹的無細胞體系成功表達了綠色熒光蛋白[67]。這些微囊體均勻分布在補充溶液中可以看成微型 CECF系統(tǒng)，脂質(zhì)體的磷脂雙分子層可以看作半透膜，可以像細胞一樣在內(nèi)部合成蛋白，內(nèi)外物質(zhì)得以交換。但是由于磷脂雙分子層缺乏細胞膜上的離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白，內(nèi)外物質(zhì)的交換效率很低，因此在基于脂質(zhì)體的無細胞反應(yīng)時共表達一些離子通道來增強磷脂雙分子層內(nèi)外的物質(zhì)交換，該方法可以構(gòu)建更接近于真實的人工細胞。這種基于微囊或脂質(zhì)體的高通量體系非常適合于利用流式細胞儀進行快速篩選。

這些高通量技術(shù)給研究人員提供了很好的研究平臺，不僅可以利用高通量無細胞技術(shù)制作蛋白組學芯片研究其相互作用及功能，還可以在脂質(zhì)體中直接表達嵌入膜中有生物活性的藥物靶標蛋白，構(gòu)建藥物的快速篩選模型。這些高通量無細胞技術(shù)為解決生物制藥業(yè)長期面臨的蛋白功能性高效表達及藥物篩選方面關(guān)鍵問題提供了新的方法與思路。

3 總結(jié)與展望

體外生物系統(tǒng)作為體內(nèi)生物系統(tǒng)的補充，許多難以在體內(nèi)進行研究的問題在其中得以解決。隨著體外系統(tǒng)構(gòu)建技術(shù)的不斷成熟，成本不斷降低，其主要研究范疇也從最初的生命基礎(chǔ)研究開始向合成生物學和生物制藥領(lǐng)域拓展，并初步展現(xiàn)出其工業(yè)應(yīng)用價值。

目前，無細胞系統(tǒng)仍有急需解決的問題：首先，以大腸桿菌為代表的原核無細胞系統(tǒng)技術(shù)上較為成熟，產(chǎn)量和成本都得到了較好的控制。但是其在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用仍然受限于糖基化等翻譯后修飾手段的缺失。而許多高價值的生物類藥物都是糖蛋白，基于CHO等哺乳動物細胞的無細胞體系表達量依然很低，遠遠達不到產(chǎn)業(yè)化需求。其研究成本不僅受限于昂貴的細胞培養(yǎng)過程，而且真核體系的內(nèi)部調(diào)控等機制也遠遠比原核生物復雜。因此發(fā)展高效廉價的符合制藥行業(yè)規(guī)范的CHO等無細胞系統(tǒng)才能真正突破其在生物制藥業(yè)上的瓶頸問題[68]。其次，無細胞蛋白表達大多數(shù)情況下仍舊著力于單個基因的表達研究，在無細胞系統(tǒng)中實現(xiàn)多基因的功能性表達可以在低遺傳背景條件下研究一系列相關(guān)蛋白的相互作用、構(gòu)建代謝流途徑和構(gòu)建多藥物靶點共篩選模型[69]，將大大拓展無細胞技術(shù)的研究范疇。

總而言之，以低廉的成本，在反應(yīng)體系中高效整合進所需的生物代謝途徑及網(wǎng)絡(luò)才能解決體外生物學最根本的問題：彌補體外生物系統(tǒng)與體內(nèi)生物系統(tǒng)在功能復雜度上的鴻溝。這些令人望而卻步的問題一旦得以解決，研究人員將根本性地掌控整個反應(yīng)體系，充分挖掘無細胞體外合成系統(tǒng)的潛力，更快更好地得到其想要的產(chǎn)品。

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