謝茹勝，葉燕珠，潘愛(ài)萍，吳水華

白芷飲片中總香豆素與歐前胡素、異歐前胡素的含量測(cè)定

*謝茹勝1，葉燕珠2，潘愛(ài)萍1，吳水華1

(1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建，福州 350002；2.福建教育學(xué)院，福建，福州 350002)

通過(guò)測(cè)定白芷傳統(tǒng)飲片中總香豆素、歐前胡素、異歐前胡素的含量，了解其在治療白癜風(fēng)中的作用和用量。采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定白芷總香豆素的含量，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定歐前胡素、異歐前胡素含量，XB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相組成為甲醇和水(70:30)，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm，流速1.0 mL·min-1。歐前胡素、異歐前胡素在范圍內(nèi)線性良好。本法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于白芷中歐前胡素與異歐前胡素的含量測(cè)定，為白芷在治療白癜風(fēng)中的作用和用量提供參考依據(jù)。

白芷；歐前胡素；異歐前胡素；含量測(cè)定

白芷為傘形科植物白芷或杭白芷的干燥根。白芷及其提取物在中醫(yī)藥、日化、煙草等行業(yè)廣泛應(yīng)用。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)白芷具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、平喘、降低動(dòng)脈壓力、具有較強(qiáng)的生理活性，能抑制銀屑病和治療白癜風(fēng)，具有拮抗副交感神經(jīng)的作用等[1-2]。白癜風(fēng)是一種后天性色素脫失皮膚病，黑素細(xì)胞破壞是其基本病理改變[3]。黑色素的減少是因?yàn)槔野彼崦富钚詼p弱, 如果使用上調(diào)酪氨酸酶活性藥物，可以提高治療白癜風(fēng)的療效[4]。實(shí)驗(yàn)研究表明，白芷中含歐前胡素、異歐前胡素，花椒毒素酯等呋喃香豆素類物質(zhì)[5]，這些物質(zhì)具有較強(qiáng)的光敏作用，能激活酪氨酸酶的活性，刺激黑素細(xì)胞增強(qiáng)合成黑素的能力，從而可以治療白癜風(fēng)。

為了研究白芷中香豆素、歐前胡素、異歐前胡素的含量，本研究采用了索氏提取[6]提取了白芷中的香豆素。目前很多研究者采用甲醇作為提取溶劑[6-7]。而通過(guò)現(xiàn)代藥理研究白芷提取的香豆素廣泛用于中醫(yī)藥[8-9]，考慮到甲醇的毒性，筆者改用了乙醇作為提取溶劑。用乙醇作為溶劑提取白芷中總香豆素和歐前胡素、異歐前胡素的含量測(cè)定鮮見(jiàn)報(bào)道，在歐前胡素、異歐前胡素的含量測(cè)定中，進(jìn)行了系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，調(diào)整了流動(dòng)相比例，不僅能同時(shí)測(cè)定歐前胡素、異歐前胡素的含量，而且測(cè)定分析時(shí)間大大縮短，提高了測(cè)定分析的工作效率，為今后測(cè)試白芷中歐前胡素和異歐前胡素提供了參考。

1 儀器與試藥

1.1 藥物與試劑

傳統(tǒng)白芷飲片（產(chǎn)地：安徽）、歐前胡素(批號(hào)：130311，純度≥ 98%)和異歐前胡素對(duì)照品(批號(hào)：130328，純度≥ 98%)均購(gòu)于天津一方科技有限公司，試劑乙醇為分析純，甲醇為色譜純。

1.2 儀器

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1800PC-DS2），高效液相色譜系統(tǒng)（島津LC-10A）；VWD檢測(cè)器；AB265-S電子天平(METTLER TOLEDO)；超聲波清洗器（型號(hào)KQ-500B ，鞏義市予華儀器廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總香豆素的測(cè)定

本研究用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定了用乙醇作為提取溶劑的白芷中總香豆素的含量[10]。白芷主要含有歐前胡素、異歐前胡素、花椒毒酚、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素等香豆素。根據(jù)吸光度隨歐前胡素濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以看出歐前胡素對(duì)照品溶液濃度在范圍內(nèi)，吸光度與濃度的線性關(guān)系良好，因此可以測(cè)定樣品在300 nm處的紫外吸收值即可通過(guò)該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到以歐前胡素表示的總香豆素含量。

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

由于香豆素成分結(jié)構(gòu)的差異，導(dǎo)致樣品的紫外吸收峰型很不規(guī)則。通過(guò)考察歐前胡素、異歐前胡素在300 nm附近有紫外吸收峰，如圖1。白芷提取液在300 nm處均有較強(qiáng)的吸收，而且峰型變化平緩，便于定量測(cè)定。故本研究采用300 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 歐前胡素對(duì)照品及總香豆素提取液紫外光譜圖

2.1.2對(duì)照品的制備

精密稱取歐前胡素對(duì)照品1.82 mg，置50 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.1.3 供試品溶液的制備

精密稱取白芷樣品粉末約5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加95 %乙醇200 mL，加熱回流4 h，提取液濃縮至適量，取出置50 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 線性范圍考察

分別移取上述對(duì)照品溶液1，2，3，4，5 mL于10 mL量瓶，加乙醇至刻度，分別搖勻即得系列對(duì)照品溶液，在300 nm處分別測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，溶度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，得線性回歸方程為= 0.0572x（R2= 0.9995），線性范圍為1.98 ~9.90 μg/mL。

取供試品溶液稀釋適量，測(cè)其吸光度，根據(jù)稀釋的倍數(shù)和上述線性方程y = 0.0572x 計(jì)算得到傳統(tǒng)白芷飲片中總香豆素的含量為0.635%。

圖2 吸光度隨歐前胡素濃度的變化

Fig.2 Standard curve of concentration-absorption of imperatorin

2.2 歐前胡素、異歐前胡素的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：XB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇一水(70:30)，等濃度洗脫，流速：1 mL/min-1。檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm。在此條件下，歐前胡素、異歐前胡素與白芷飲片中其他成分能達(dá)到基線分離（R﹥1.5），理論塔板數(shù)按歐前胡素峰計(jì)算不低于3000。對(duì)照品及供試品色譜圖見(jiàn)圖3和圖4。

（1.歐前胡素 2.異歐前胡素）

（1.歐前胡素 2.異歐前胡素）

2.2.2 歐前胡素、異歐前胡素對(duì)照品的配制

分別稱取歐前胡素、異歐前胡素對(duì)照品1 mg，精密稱定，配制成50 mL量瓶中，以乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得貯備液。

2.2.3 線性范圍的考察

分別配制歐前胡素、異歐前胡素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以對(duì)照品溶度對(duì)橫坐標(biāo)，峰面積（A）積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。歐前胡素線性范圍為1.98~9.90 μg/mL，線性范圍為1.13 ~11.3 μg/mL。結(jié)果表明，歐前胡素、異歐前胡素在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖5 歐前胡素峰面積隨濃度的變化曲線

圖6 異歐前胡素對(duì)照品及總香豆素提取液紫外光譜圖

2.2.4 精密度試驗(yàn)

按上述色譜條件，以歐前胡素、異歐前胡素對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣5次，以峰面積計(jì)算，歐前胡素的RSD = 0.9%，異歐前胡素的RSD = 0.7%。

2.2.5 樣品含量測(cè)定

取2.1.3項(xiàng)下超聲提取供試液經(jīng)濾膜過(guò)濾，精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣3次，測(cè)定峰面積，根據(jù)2.2.2項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出白芷樣品中歐前胡素、異歐前胡素平均含量分別為0.092%、0.094%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.2.5項(xiàng)下供試品溶液，在室溫下放置，按上述色譜條件，分別在1、3、5、7、9 h 測(cè)定，以峰面積計(jì)算，歐前胡素的RSD = 0.5%，異歐前胡素的RSD = 0.6%，表明供試品溶液在9 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3 結(jié)論

筆者通過(guò)調(diào)查了解到漳州龍海地區(qū)民間治療白癜風(fēng)的中藥材主要有復(fù)方中藥白芷等其他成分，取5 g研磨打成粗粒，加入煤油中浸泡，每天用棉簽涂藥液于患處，每日數(shù)次，連續(xù)涂4 d左右，白斑皮膚開始變紅后漸黑，一周后灶部位皮膚（即黑色部分）可以剝離一薄層皮膚，兩周后灶部位皮膚可恢復(fù)正常膚色。盡管療效顯著，但是其作用機(jī)理不明確，存在溶出差、粘著性差及使用不方便等問(wèn)題。

根據(jù)2010版《中國(guó)藥典》白芷[11]項(xiàng)下歐前胡素的含量測(cè)定方法，同時(shí)測(cè)定歐前胡素、異歐前胡素的含量，進(jìn)行了系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，調(diào)整了流動(dòng)相比例，由原來(lái)甲醇與水的比例由55:45調(diào)整為70:30。能同時(shí)測(cè)定歐前胡素、異歐前胡素的含量，而且測(cè)定分析時(shí)間從原來(lái)1 h縮短至12 min，提高了測(cè)定分析的工作效率。

筆者結(jié)合文獻(xiàn)并實(shí)驗(yàn)研究了白芷的主要活性成分。本研究采用了索氏提取白芷中的香豆素，考慮到白芷提取的香豆素廣泛用于中醫(yī)藥，關(guān)系人類健康，筆者改用了乙醇作為提取溶劑，用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定了白芷中總香豆素的含量為0.533%。并采用HPLC同時(shí)測(cè)定歐前胡素、異歐前胡素含量分別為0.092%、0.094%。盡管用乙醇作為白芷中的提取溶劑時(shí)，總香豆素包括歐前胡素、異歐前胡素的含量比用甲醇作為溶劑時(shí)有所降低，但使用更安全。其成分和含量分析可以為今后在治療白癜風(fēng)中白芷的主要作用成分和白芷復(fù)方軟膏制劑用量或者規(guī)格的選擇提供參考依據(jù)。

[1] 吳媛媛,蔣桂華,馬逾英,等.白芷的藥理作用研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(3):625-627.

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[11] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(Ⅰ部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:98.

CONTENT DETERMINATION OF TOTAL COUMARINS, IMPERATORIN AND ISOIMPERATORIN IN ANGELICAE DAHURICAE DECOCTION PIECES

*XIE Ru-sheng1, YE Yan-zhu2, PAN Ai-ping1, WU Shui-hua1

(1. Fujian Vocational College of Bioengineering, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2. Fujian Institute of Education, Fuzhou, Fujian 350002, China)

：To understand the role and dosage in the treatment of vitiligo by determining the contents of total coumarins, imperatofin and isoimperatorin in Angelicae Dahuricae decoction pieces.: The content of coumarins was measured by UV-VIS spectrophotometry, the contents of imperatofin and isoimperatorin were measured by HPLC with a Zorbax XB-C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) column, a mobile phase of methanol-water volume ratio as 70:30, a detection wavelength of 300 nm and a flow rate of 1 mL/min.：The results showed that imperatorin and isoimperatorin were in good linearity within certain ranges.: The method is rapid, simple and accurate for the content determination of imperatorin and isoimperatorin in Angelicae Dahuricae decoction pieces, and will provide a reference basis on the role and dosage of in the treatment of vitiligo.

Angelicae Dahuricae decoction pieces; imperatorin; isoimperatorin; determination

R282

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2014.06.019

1674-8085(2014)06-0088-04

2014-08-15；

2014-10-19

福建省教育廳A類科技項(xiàng)目(JA11336)

*謝茹勝(1978-)，女，福建龍海人，講師，主要從事分析化學(xué)的研究(E-mail:xierusheng78@163.com）;

葉燕珠(1979-)，女，福建南安人，講師，主要從事結(jié)構(gòu)化學(xué)的研究(E-mail:29713222@qq.com）;

潘愛(ài)萍(1974-)，女，福建福州人，講師，主要從事藥物化學(xué)的研究(E-mail:229878284@qq.com）;

吳水華(1978-)，女，福建龍巖人，講師，主要從事中藥藥物分析的研究(E-mail:47287499@qq.com）