付紹智+楊曉燕+燕志強(qiáng)+金輝+張等宏+秦波

摘要：以模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）為受體，采用活體生物試驗(yàn)方法測定澤瀉[Alisma orientalis（Sam.）Juzep.]醇提物及其主要萜類活性成分對7日齡擬南芥幼苗生長的影響。結(jié)果表明，澤瀉醇提物對擬南芥幼苗的生長有較強(qiáng)的抑制作用，23-乙酰澤瀉醇B對擬南芥幼苗的生長表現(xiàn)出抑制作用，呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。而澤瀉醇A醋酸酯對擬南芥幼苗的生長無明顯影響。研究證明澤瀉醇提物對擬南芥幼苗的生長有顯著的抑制作用，其中23-乙酰澤瀉醇B是澤瀉潛在的化感活性成分。

關(guān)鍵詞：澤瀉[Alisma orientalis（Sam.）Juzep.]；萜類化合物；擬南芥（Arabidopsis thaliana）；23-乙酰澤瀉醇B

中圖分類號：Q148.12 文章標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）15-3556-04

Inhibitory Effects of the Ethanol Extract and Two Triterpenoids from Alisma orientalis on the Growth of Arabidopsis thaliana Seedling

FU Shao-zhi1， YANG Xiao-yan2， YAN Zhi-qiang2，JIN Hui2， ZHANG Deng-hong2， QIN Bo2

（1. Chongqing Three Gorges Medical College of traditional Chinese Medicine Research Institute， Chongqing 404120，China ；2. Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources/Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province， Lanzhou Institute of Chemical Physics， Chinese Academy of Sciences， Lanzhou 730000，China）

Abstract： The inhibitory effects of the ethanol extract and two triterpenoids from Alisma orientalis on the 7-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana were studied and compared with bioassay methods.The results showed that the ethanol extract had significant inhibitory activity on the growth of Arabidopsis thaliana seedling 23-O-Acetylalisol B significantly reduced the fresh weight and root length of Arabidopsis thaliana seedlings， with a dose-dependent phytotoxic effect. Alisol A 24-acetate had no effect on the growth of Arabidopsis thaliana seedlings. The extract had a significant inhibitory effect on Alisma orientalis. 23-O-Acetylalisol B might be a potential allelopathic active substance of Alisma orientalis.

Key words：Alisma orientalis（Sam.） Juzep.； Triterpenoids； Arabidopsis thaliana； 23-O-Acetylalisl B

收稿日期：2014-01-10

基金項(xiàng)目：國家自然基金項(xiàng)目（31070386；21102154）；重慶市科技攻關(guān)項(xiàng)目（CSTC2011AC5140）

作者簡介：付紹智（1965-），男，重慶云陽人，副教授，碩士，主要從事藥用植物資源與生態(tài)學(xué)的研究，（電話）13896380613（電子信箱）fushaozhi@sina.com；

秦 波（1966-），男，甘肅鎮(zhèn)原人，研究員，博士，主要從事植物化學(xué)生態(tài)學(xué)的研究，（電話）0931-4968372（電子信箱）bqin@licp.cas.cn。

澤瀉[Alisma orientalis（Sam.）Juzep.]為澤瀉科多年沼生草本植物，其干燥塊莖作為傳統(tǒng)常用中藥，具有利水滲濕的功效，主產(chǎn)于福建（建澤瀉）和四川（川澤瀉）等地，叢生于淺水或沼澤邊緣[1，2]。澤瀉含有多種萜類化合物，具有抗血栓、降血脂、利尿、抗脂肪肝、抗腎炎、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[3，4]。研究水生植物的毒活性物質(zhì)、化感作用對水質(zhì)凈化、水環(huán)境治理及生態(tài)文明建設(shè)具有重要意義[5，6]。迄今為止，對于長期生長在溫濕水環(huán)境下的澤瀉的化感作用和植物毒活性物質(zhì)尚未見研究報(bào)道[7，8]。本研究以擬南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗為活性試驗(yàn)受體，對澤瀉醇提物和澤瀉體內(nèi)主要活性成分23-乙酰澤瀉醇B及澤瀉醇A醋酸酯的植物毒活性作用進(jìn)行研究，以期為澤瀉植物毒活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)及其資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 澤瀉醇提物制備 澤瀉采自重慶市梁平縣城北鄉(xiāng)兩路村，地下塊莖40 ℃低溫烘干，稱取100 g塊莖組織粉碎后用75%乙醇提取，提取液減壓濃縮，獲得澤瀉濃縮浸膏低溫保存待用。

1.1.2 受體植物 擬南芥Col野生型種子由蘭州大學(xué)生命科學(xué)院劉恒副教授實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 澤瀉萜類成分 23-乙酰澤瀉醇B（CAS NO：26575-95-1）購自成都曼思特生物科技有限公司，澤瀉醇A醋酸酯（CAS NO：18674-16-3）購自上海永恒生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥培養(yǎng) 將擬南芥種子置于4 ℃冰箱避光放置3 d，70%乙醇表面消毒30 s，去離子水清洗3次，0.1%氯化汞表面消毒7 min，去離子水清洗6次，播于1/2 MS固體培養(yǎng)基上（直徑為9 cm的培養(yǎng)皿），置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)光照強(qiáng)度為2 000 lx，光周期（L；D）為光16 h∶暗8 h，培養(yǎng)溫度22 ℃。

1.2.2 澤瀉醇提物對擬南芥幼苗生長影響的測定 稱取澤瀉醇提物141.2 mg，加入甲醇溶解，配制成濃度為80 mg/mL的母液1.765 mL，經(jīng)無菌濾膜過濾，用去離子水配制成4個(gè)濃度梯度（5、10、20、40 mg/mL）的處理溶液。在24孔板中每孔加入1/2 MS液體培養(yǎng)基990 μL及上述4個(gè)濃度的試驗(yàn)樣品溶液各10 μL，于超凈工作臺中接種7日齡擬南芥幼苗，使試驗(yàn)組的終濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/mL。置于恒溫光照搖床中培養(yǎng)7 d后，用濾紙吸去水分，稱量擬南芥幼苗鮮重，并測量其根長。每處理各設(shè)3個(gè)重復(fù)，以同樣比例的甲醇作對照（0 mg/mL濃度組），甲醇的用量不超過總體積的1%，恒溫?fù)u床的培養(yǎng)溫度22 ℃，轉(zhuǎn)速105 r/min.，光照周期（L∶D）為16 h∶8 h。

1.2.3 23-乙酰澤瀉醇B和澤瀉醇A醋酸酯對擬南芥幼苗生長影響的測定 分別稱取23-乙酰澤瀉醇B標(biāo)準(zhǔn)品2.00 mg和瀉醇A醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)品2.02 mg，加入100 μL甲醇溶解，分別配制成濃度為20 mg/mL的母液，經(jīng)無菌濾膜過濾，用去離子水配成4個(gè)濃度梯度（試驗(yàn)組終濃度為0.025、0.050、0.100、0.200 mg/mL）的處理溶液。其他試驗(yàn)方法同1.2.2。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

測量數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析。

相對鮮重=處理組幼苗鮮重/對照組幼苗根長×100%

相對根長=處理組幼苗根長/對照組幼苗根長×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 澤瀉醇提物對擬南芥幼苗鮮重的影響

用不同濃度的澤瀉醇提物處理7日齡擬南芥幼苗，對擬南芥幼苗鮮重抑制作用及其顯著性分析結(jié)果見圖1。由圖1可見，與澤瀉醇提物對擬南芥幼苗的生長有較強(qiáng)的抑制作用，呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。與對照相比，0.05、0.10、0.20 mg/mL澤瀉醇提物處理組對擬南芥幼苗生長的抑制作用達(dá)顯著水平（P<0.05），經(jīng)0.40 mg/mL澤瀉醇提物處理組差異達(dá)極顯著水平（P<0.01）。0.40 mg/mL澤瀉醇提物處理后擬南芥幼苗鮮重僅為對照的45.03%。

2.2 澤瀉醇提物對擬南芥幼苗根長的影響

澤瀉醇提物在不同濃度條件下，對擬南芥幼苗根長的影響測定結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，澤瀉醇提物對擬南芥幼苗根長有較強(qiáng)的抑制作用，呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。與對照組相比，0.10、0.20 mg/mL處理組對擬南芥幼苗根長的抑制達(dá)顯著水平（P<0.05）， 0.40 mg/mL澤瀉醇提物處理組差異達(dá)極顯著水平（P<0.01）。0.40 mg/mL澤瀉醇提物處理后擬南芥幼苗根長僅為對照的38.06%。

2.3 萜類化合物23-乙酰澤瀉醇B和澤瀉醇A醋酸酯對擬南芥幼苗鮮重的影響

在不同濃度條件下，23-乙酰澤瀉醇B和澤瀉醇A醋酸酯對擬南芥幼苗鮮重的影響測定結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，23-乙酰澤瀉醇B對擬南芥幼苗鮮重有較強(qiáng)的抑制作用，呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，0.100 mg/mL 23-乙酰澤瀉醇B處理后擬南芥幼苗鮮重僅為對照的51.17%。同等濃度下，澤瀉醇A醋酸酯對擬南芥幼苗鮮重?zé)o明顯影響。

2.4 萜類化合物23-乙酰澤瀉醇B和澤瀉醇A醋酸酯對擬南芥幼苗根長的影響

23-乙酰澤瀉醇B和澤瀉醇A醋酸酯對擬南芥幼苗根長的影響測定結(jié)果如圖4至圖6所示，由圖4、圖5可見，23-乙酰澤瀉醇B對擬南芥幼苗根長在0.050 mg/mL濃度時(shí)開始表現(xiàn)出抑制效果，隨著濃度的增大其抑制作用越來越強(qiáng)，0.200 mg/mL濃度處理后擬南芥幼苗根長僅為對照的37.10%。澤瀉醇A醋酸酯在0.200 mg/mL濃度時(shí)對擬南芥幼苗根長表現(xiàn)出一定的抑制作用（圖4、圖6），但與對照相比無顯著差異。

3 小結(jié)與討論

澤瀉次生代謝物的主要成分為萜類物質(zhì)[9]。萜類是天然物質(zhì)中種類最多的一類，也是一類重要的化感物質(zhì)[10]。萜類化感物質(zhì)合成后大多通過植物體揮發(fā)或根系分泌等途徑進(jìn)入土壤，從而影響自身及鄰近植物的生長[11-17]。通過對兩種澤瀉萜類活性物質(zhì)23-乙酰澤瀉醇B及澤瀉醇A醋酸酯進(jìn)行研究，結(jié)果表明，23-乙酰澤瀉醇B能夠顯著抑制擬南芥幼苗的生長，而澤瀉醇A醋酸酯對擬南芥幼苗生長沒有明顯抑制作用，這可能與兩種萜類活性物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)及所含活性基團(tuán)不同有關(guān)[17]。23-乙酰澤瀉醇B對擬南芥幼苗生長的影響表現(xiàn)出較特殊的作用效果，當(dāng)濃度為0.200 mg/mL時(shí)，其對擬南芥幼苗的鮮重和根長的抑制作用較濃度為0.100 mg/mL時(shí)有所減弱，而澤瀉醇提物也表現(xiàn)出相似的作用效果。結(jié)果表明，23-乙酰澤瀉醇B是澤瀉醇提物的重要有效成分，可作為新型植物源農(nóng)藥開發(fā)的活性先導(dǎo)物質(zhì)，同時(shí)也可作為潛在的化感物質(zhì)，對澤瀉生長的周圍環(huán)境中其他植物的生長發(fā)育產(chǎn)生抑制作用。

近年來，水環(huán)境的污染治理成為備受社會關(guān)注的問題之一。目前，通過水生植物治理水體污染從而凈化水質(zhì)是研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。水生植物在水體中重要的生態(tài)功能使其在水環(huán)境治理中具有很大的應(yīng)用價(jià)值[18]。水生植物通過其植物毒活性物質(zhì)及化感作用對水環(huán)境中的污染源如水華藻類等產(chǎn)生抑制作用，從而達(dá)到治理水體污染的目的[19]。本研究選取淺水水生植物澤瀉為供體，用澤瀉醇提物對擬南芥幼苗進(jìn)行生長抑制試驗(yàn)。研究結(jié)果表明澤瀉醇提物對擬南芥幼苗的鮮重和根長都有明顯的抑制作用。在濃度為0.40 mg/mL時(shí)，擬南芥幼苗鮮重僅為對照的45.03%，根長僅為對照的38.06%，可見澤瀉具有良好的化感作用潛力。同時(shí)，通過對澤瀉中兩種重要萜類化合物活性作用的研究發(fā)現(xiàn)，23-乙酰澤瀉醇B能夠顯著抑制擬南芥幼苗生長，在濃度為0.100 mg/mL時(shí)，擬南芥幼苗鮮重僅為對照的51.17%，根長僅為對照的37.10%，可見23-乙酰澤瀉醇B是澤瀉的重要有效活性成分，可作為潛在的化感物質(zhì)發(fā)揮作用。因此，進(jìn)一步深入地開展?jié)蔀a化感作用的研究，在由水體富營養(yǎng)化等因素造成的藻類污染治理方面具有重要意義[20]。

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