秦璽 ，徐小潔，饒春明，高凱，楊琦，史新昌 ，于雷 ，周勇 ，楊玉帥，程龍，葉棋濃，王軍志

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院 生物制品檢定所，北京 100050；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

隨著全球工業(yè)化、城市化的加速，各種致癌因素不斷增多，腫瘤已成為威脅人類生命的最大殺手。乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)《2013中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》統(tǒng)計(jì)顯示，乳腺癌居女性惡性腫瘤第一位，占女性所有腫瘤的16.97%，每年新發(fā)病例約21萬(wàn)。microRNA（miRNA）是重要的基因調(diào)節(jié)因子，它參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡、胰島素分泌，以及心臟、大腦和骨骼肌的發(fā)育過(guò)程[1-5]。雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）屬于核受體家族，通過(guò)與其配體雌激素（E2）的結(jié)合，激活啟動(dòng)子中含雌激素應(yīng)答元件（ERE）的基因表達(dá)，包括周期蛋白D1、組織蛋白酶（cathepsin，Cat）D、c-myc、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）、Bcl-2/BclXL、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等。ERα水平或由其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的改變，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生命活動(dòng)的紊亂，誘發(fā)乳腺癌等癌癥[6-12]。我們通過(guò)轉(zhuǎn)染多個(gè)miRNA的表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)miR-424能夠抑制ERα的表達(dá)水平，為下一步研究miRNA在ER信號(hào)通路中的生物學(xué)功能及阻抑乳腺癌的進(jìn)程奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細(xì)胞MCF-7、ZR75-1，細(xì)胞裂解液購(gòu)自天根生化科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Promega公司；ERα抗體、CatD抗體和GAPDH抗體購(gòu)自Sigma公司；SDS-PAGE膠和PVDF轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購(gòu)自Invitro?gen 公司；miRNA-424、miRNA-497、miRNA-429、miRNA-219表達(dá)載體由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所鄭曉飛教授饋贈(zèng)；miRNA-424抑制劑購(gòu)自QIAGEN公司。

1.2 Western印跡

轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液及SDS加樣緩沖液，煮沸15 min，12 000 r/min離心2 min，上清液進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后將膠轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，用ERα抗體（1∶1000）孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，將含辣根過(guò)氧化物酶的ECL底物滴于膜上反應(yīng)5 min，吸干后用X線膠片顯影。

1.3 生長(zhǎng)曲線

24孔板的每孔中加入約2000個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后分別在24、48、72、96和120 h收集細(xì)胞；在細(xì)胞懸液中加入MTT，于37℃孵育4 h；加入脫色液，37℃至少靜置30 min，使甲質(zhì)顆粒充分溶解；轉(zhuǎn)入96孔板孔中，在酶標(biāo)儀上讀取D570nm值，每個(gè)點(diǎn)為3個(gè)平行樣品的平均值。

2 結(jié)果

2.1 抑制ERα表達(dá)的miRNA篩選

6 cm2皿中接種ZR75-1細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)到70%～90%時(shí)，將miR-424、miR-497、miR-429、miR-219及對(duì)照分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h換為新鮮培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞后，進(jìn)行Western印跡，用ERα抗體檢測(cè)ZR75-1細(xì)胞中內(nèi)源ERα的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，miR-424能夠抑制ZR75-1細(xì)胞中內(nèi)源ERα的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-497、miR-429、miR-219的實(shí)驗(yàn)組ERα的表達(dá)不變（圖1）。為了進(jìn)一步確定miR-424對(duì)ERα表達(dá)的作用，在ZR75-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-424抑制劑，降低細(xì)胞內(nèi)miR-424水平后，ERα表達(dá)得到提高（圖2）。綜上，說(shuō)明miR-424能夠降低ZR75-1細(xì)胞中ERα的水平。

2.2 miR-424能夠降低ERα及其下游基因CatD的水平

圖1 Western印跡檢測(cè)多個(gè)miRNA表達(dá)載體對(duì)ZR75-1細(xì)胞內(nèi)源ERα表達(dá)的影響

6 cm2皿中接種ZR75-1細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)到70%～90%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染miR-424和對(duì)照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后6 h換為新鮮培養(yǎng)基，并分為加E2組與不加E2組，48 h后收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞后進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn)，分別用ERα抗體和CatD抗體檢測(cè)ZR75-1細(xì)胞中內(nèi)源ERα及其下游基因CatD的表達(dá)。結(jié)果見(jiàn)圖3，與陰性對(duì)照組相比，miR-424能夠明顯抑制ERα及CatD的水平；E2能夠促進(jìn)ERα及CatD的表達(dá)，但對(duì)miR-424抑制ERα和CatD的作用沒(méi)有影響。說(shuō)明miR-424能夠抑制ERα及其下游基因的表達(dá)，且miR-424對(duì)ERα及其下游基因的抑制作用并不依賴于E2的參與。

2.3 miR-424抑制乳腺癌細(xì)胞ZR75-1的生長(zhǎng)

24孔板中接種ZR75-1細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)到70%～90%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染miR-424和陰性對(duì)照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后6 h換為新鮮培養(yǎng)基，并分為加E2組與不加E2組，分別在24、48、72、96、120 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖4，與對(duì)照組相比，miR-424能夠抑制ZR75-1的生長(zhǎng)；E2能夠促進(jìn)ZR75-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，但在轉(zhuǎn)染miR-424的實(shí)驗(yàn)組，E2并不能回復(fù)miR-424對(duì)ZR75-1細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，進(jìn)一步表明，miR-424對(duì)ERα的抑制作用并不依賴E2的參與。

圖2 Western印跡檢測(cè)多個(gè)miR-424抑制劑對(duì)ZR75-1細(xì)胞內(nèi)源ERα表達(dá)的影響

圖3 Western印跡檢測(cè)miR-424對(duì)ZR75-1細(xì)胞內(nèi)源ERα及下游基因表達(dá)的影響

圖4 CCK-8法檢測(cè)miR-424對(duì)ZR75-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

3 討論

miRNA是一類調(diào)控基因表達(dá)的非編碼內(nèi)源性小RNA分子，廣泛存在于哺乳動(dòng)物、線蟲(chóng)、果蠅和植物等生物中，長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸，通過(guò)與靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)完全或不完全結(jié)合，抑制蛋白的翻譯或降解mRNA[13-14]，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是作為癌基因還是抑癌基因發(fā)揮作用，取決于它們調(diào)控的靶點(diǎn)[15]。miRNA與腫瘤的關(guān)系緊密[16-18]，腫瘤的發(fā)生總伴隨有多條miRNA的表達(dá)異常，這給腫瘤的診斷和治療開(kāi)辟了一條新的途徑[19-23]。但目前，在腫瘤中關(guān)于miRNA的研究大部分停留在其表達(dá)水平的異常，而對(duì)miRNA的表達(dá)調(diào)控及其與轉(zhuǎn)錄靶mRNA和作用靶點(diǎn)的特異性對(duì)應(yīng)關(guān)系尚知之甚少。

在乳腺癌癌變前及發(fā)生癌變的組織中，ERα表達(dá)的正常調(diào)控遭到破壞，表現(xiàn)為表達(dá)水平的顯著提高或發(fā)生對(duì)雌激素敏感性的改變。目前，乳腺癌內(nèi)分泌治療主要通過(guò)降低ERα的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)實(shí)現(xiàn)，然而長(zhǎng)期的內(nèi)分泌治療卻又會(huì)使腫瘤細(xì)胞對(duì)抗雌激素藥物等產(chǎn)生抗性。在本研究中，miR-424對(duì)乳腺癌相關(guān)基因ERα及其下游基因有明顯的抑制作用，并且阻礙了ERα陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞株ZR75-1的生長(zhǎng)。通過(guò)miR-424在轉(zhuǎn)錄后對(duì)ERα及其下游基因的調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)ZR75-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。該結(jié)果對(duì)于開(kāi)發(fā)運(yùn)用于診斷和治療ERα陽(yáng)性乳腺癌患者的新分子標(biāo)志物提供了線索，為進(jìn)一步研究阻抑乳腺癌進(jìn)程和治療有重要啟示，并提供了新的方向。

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