虞劍，黃勇，周長(zhǎng)林，童貽剛，方宏清

1.中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 a.生物工程研究所；b.微生物流行病研究所；北京 100071

大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主，遺傳背景清楚，技術(shù)操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)，倍受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應(yīng)用最廣泛、最成功的表達(dá)體系，常作為高效表達(dá)的首選體系。在大腸桿菌基因組中，存在一些非必需序列，這些序列的刪除不會(huì)對(duì)生物穩(wěn)定性或基因產(chǎn)物造成不利影響。這些非必需序列包括插入序列元件、限制性修飾系統(tǒng)基因、破壞外源性DNA的核酸內(nèi)切酶基因和一些鞭毛基因家族等[1]。插入序列元件的存在能夠影響基因組的穩(wěn)定性。鞭毛負(fù)責(zé)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)，在工業(yè)生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室條件下，細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性對(duì)于細(xì)胞生產(chǎn)和生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)并不是必需的，相反，這些鞭毛的存在增加了細(xì)胞的耗能，因此這些鞭毛基因也是可刪除的元件。Baba等[2]于2006發(fā)表了一項(xiàng)關(guān)于大腸桿菌基因必需性的研究結(jié)果，涉及絕大多數(shù)的大腸桿菌基因。他們構(gòu)建了大批量單個(gè)基因缺失的突變株，對(duì)這些突變株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合遺傳足跡法、大腸桿菌染色體研究數(shù)據(jù)庫(kù)、系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座子誘變法對(duì)大腸桿菌一系列基因必需性進(jìn)行判定，對(duì)每個(gè)受檢測(cè)的基因給出了必需性評(píng)分，為大腸桿菌基因組研究提供了大量可參考信息。

細(xì)胞工廠，即一個(gè)可控性和可預(yù)料性更強(qiáng)的單元系統(tǒng)[3]。近年來(lái)，一些國(guó)家開(kāi)始了構(gòu)建細(xì)胞工廠的項(xiàng)目。第五次歐盟框架計(jì)劃執(zhí)行了細(xì)胞工廠項(xiàng)目，期望構(gòu)建的細(xì)胞工廠能在代謝工程領(lǐng)域有優(yōu)異的表現(xiàn)。日本也在2001年啟動(dòng)了最小化基因工廠（MGF）計(jì)劃，在該計(jì)劃中，一些模型微生物被遺傳改造，從而獲得基因組減小后的細(xì)胞，并期望構(gòu)建的基因組最小化細(xì)胞能作為細(xì)胞工廠體系的理想平臺(tái)，已獲得一些典型的成果。如2002年，Kolisnychenko等[1]將大腸桿菌MG1655的基因組減小了8.1%，得到MDS12菌株，菌株的生長(zhǎng)特性沒(méi)有發(fā)生改變；2006年，Posfai等[4]報(bào)道，他們完全刪除了大腸桿菌MG1655中的可移動(dòng)元件，基因組減小率達(dá)15%，得到了MDS43菌株，其生長(zhǎng)特性沒(méi)有發(fā)生改變，同時(shí)基因組穩(wěn)定性得到了提高，使得電轉(zhuǎn)效率提高，并可表達(dá)一些毒素蛋白；2008年，Mizoguchi等[5]對(duì)大腸桿菌W3110進(jìn)行了基因組連續(xù)刪減，使基因組減小了22%，得到菌株MFG-01，菌株的生長(zhǎng)特性并沒(méi)有發(fā)生改變，同時(shí)提高了1.5倍的細(xì)胞密度，且改造后蘇氨酸的產(chǎn)量提高了2.4倍。除了關(guān)于基因組減小菌株在生長(zhǎng)特性、細(xì)胞密度、電轉(zhuǎn)效率及產(chǎn)物表達(dá)能力等方面的報(bào)道外，在2005年Hashimoto[6]等發(fā)表的文章中，還提到了關(guān)于大腸桿菌基因組減小菌株在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的變化：基因組刪減菌株的細(xì)胞長(zhǎng)度和寬度會(huì)發(fā)生改變，對(duì)基因組較大比例的刪減會(huì)使突變體細(xì)胞變得更長(zhǎng)更寬，甚至一些表型會(huì)和球狀細(xì)胞類似。這一報(bào)道或許有助于一些未知基因功能的研究。本研究的目的是通過(guò)基因組比對(duì)的方法，確定實(shí)驗(yàn)室常用的大腸桿菌DH1中的非必需序列，為構(gòu)建基因組減小的大腸桿菌底盤(pán)細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株基因組序列

大腸桿菌DH1、MG1655、W3110全基因組序列及注釋來(lái)自GenBank。

1.2 大腸桿菌全基因組比對(duì)

利用軟件包Lasergene中的EditSeq軟件對(duì)查詢到的MG1655、W3110全基因組序列進(jìn)行編輯，去除文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道中的已敲除區(qū)域序列，將得到的基因序列 分 別 命 名 為 miniMG1655、miniW3110；通 過(guò)MAUVE軟件將DH1的基因組分別與miniMG1655、miniW3110的基因組進(jìn)行比對(duì)，得到DH1基因組上多出的序列區(qū)域，稱為候選非必需區(qū)域。

1.3 大腸桿菌DH1基因組中非必需區(qū)域的篩選

為了避免因3株菌基因組的差異性而使必需序列被包含在候選非必需序列區(qū)域中，根據(jù)文獻(xiàn)中對(duì)大腸桿菌基因必需性和非必需性的研究[2,7]，評(píng)價(jià)候選非必需區(qū)域中所包含基因的必需性，從而篩選出包含非必需基因的序列區(qū)域，稱為大腸桿菌DH1基因組上的非必需區(qū)域。以文獻(xiàn)中單基因突變庫(kù)、遺傳足跡分析、大腸桿菌染色體研究數(shù)據(jù)庫(kù)、轉(zhuǎn)座子突變庫(kù)等對(duì)大腸桿菌基因必需性的評(píng)價(jià)結(jié)果為基礎(chǔ)，對(duì)于同一個(gè)基因，將4種評(píng)價(jià)體系的評(píng)分相加后得到一個(gè)總評(píng)分?？傇u(píng)分越低，對(duì)應(yīng)基因的必需程度就越?。豢傇u(píng)分越高，對(duì)應(yīng)基因的必需程度就越大。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌全基因組序列

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,從GenBank下載得到3種大腸桿菌的全基因組序列及其基因組注釋（表1）。

2.2 大腸桿菌基因組比對(duì)

通過(guò)軟件MAUVE對(duì)DH1與miniMG1655、miniW3110進(jìn)行基因組比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢灾庇^地看出，和miniMG1655、miniW3110相比，DH1基因組中有很多空白區(qū)，這些空白區(qū)即代表與對(duì)照基因組相比多余的序列區(qū)域。由于DH1、MG1655、W3110菌株間的同源性非常高，所以這些空白區(qū)基本都與文獻(xiàn)報(bào)道中miniMG1655、miniW3110的已敲除區(qū)域一致。我們將這些區(qū)域整理出來(lái)，與文獻(xiàn)中的敲除區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)分析，歸納并確定了大腸桿菌DH1中的候選非必需區(qū)域。

2.3 DH1基因組中非必需區(qū)域的確定

根據(jù)文獻(xiàn)[2]報(bào)道中大腸桿菌基因的必需性評(píng)分，對(duì)候選非必需區(qū)域中的基因進(jìn)行必需性評(píng)價(jià)分析，以其中部分基因?yàn)槔M(jìn)行必需性評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表2，分?jǐn)?shù)越低，表明基因的非必需性越高。在對(duì)所有候選非必需區(qū)域中的基因進(jìn)行評(píng)分后，保留必需基因，并整理得到了64個(gè)非必需區(qū)域，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

細(xì)胞工廠作為一個(gè)全新的概念，在微生物領(lǐng)域漸漸嶄露頭角。更多的國(guó)家開(kāi)始實(shí)施或計(jì)劃實(shí)施細(xì)胞工廠項(xiàng)目，因?yàn)榈玫揭粋€(gè)好的細(xì)胞工廠，例如經(jīng)基因組最小化改造的大腸桿菌MFG-01[5]，其遺傳的穩(wěn)定性、對(duì)產(chǎn)物的高表達(dá)能力可以為工業(yè)化生產(chǎn)帶來(lái)全新的飛躍式發(fā)展。

大腸桿菌是最常用、研究最多的宿主菌，但在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中攜帶了大量對(duì)細(xì)胞工廠底盤(pán)不必需的序列。這些序列導(dǎo)致大腸桿菌的遺傳不穩(wěn)定，影響細(xì)胞工廠的效率及穩(wěn)定性。將這些非必需序列刪除，構(gòu)建遺傳穩(wěn)定、背景干凈，并具有魯棒性（robust）代謝行為的底盤(pán)細(xì)胞，可以提高異源途徑的合成效率，提高目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)水平。這些優(yōu)勢(shì)使得大腸桿菌成為構(gòu)建細(xì)胞工廠的首選菌株。

表1 菌株編號(hào)、GI及基因組長(zhǎng)度

圖1 大腸桿菌DH1和miniMG1655（上圖）、miniW3110（下圖）基因組比對(duì)圖

在大腸桿菌基因組減小的過(guò)程中，面臨的首要問(wèn)題是確定非必需序列區(qū)域。需要對(duì)基因的必需性有充分的認(rèn)識(shí)，才能合理選擇非必需序列區(qū)域。目前主要利用比較基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和代謝網(wǎng)絡(luò)計(jì)算模擬等方法初步預(yù)測(cè)、分析識(shí)別必需基因及非必需基因，并結(jié)合單基因或多基因組合敲除試驗(yàn)加以確證[8]。而隨著新基因的不斷發(fā)現(xiàn)，如新小分子蛋白質(zhì)基因和小分子RNA基因的發(fā)現(xiàn)，使得非必需基因之間的區(qū)域是否都是非必需序列成為未知，所以通過(guò)非必需基因確定非必需序列區(qū)域具有一定的局限性。例如，目前在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的小分子蛋白質(zhì)扮演著多種角色，如yobF基因與菌株的耐酸能力相關(guān)[9]；blr基因可調(diào)節(jié)菌株對(duì)細(xì)胞膜壓力的敏感性[9]；ykgO基因受到鋅的抑制[10]，其編碼的蛋白YkgO可以在鋅缺失的條件下發(fā)揮核糖體功能[11]；rpmH編碼的小分子蛋白與內(nèi)膜蛋白的嵌入相關(guān)[12]；還有一些基因組編碼的小分子蛋白質(zhì)，在高濃度時(shí)表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，如ShoB蛋白[13]。由于已知小分子蛋白質(zhì)的功能多樣性，且在大腸桿菌中還存在許多未知功能的小分子蛋白質(zhì)，所以在大腸桿菌基因組改造過(guò)程中，必須考慮到編碼小分子蛋白質(zhì)基因?qū)Ω脑炷康牡挠绊憽?/p>

表2 候選非必需區(qū)域中基因的必需性評(píng)價(jià)

在本研究中，由于大腸桿菌DH1、MG1655、W3110菌株基因組的同源性非常高，故參考MG1655、W3110非必需區(qū)域刪減的相關(guān)文獻(xiàn)，通過(guò)軟件MAUVE進(jìn)行基因組比對(duì)，得到類似的候選非必需區(qū)域，縮小了非必需區(qū)域篩選范圍，然后根據(jù)大腸桿菌非必需基因的文獻(xiàn)報(bào)道確定了DH1基因組上64個(gè)非必需區(qū)域。這為后續(xù)利用實(shí)驗(yàn)室成熟的Red同源重組技術(shù)[14]構(gòu)建基因組最小化的底盤(pán)細(xì)胞miniDH1提供了基礎(chǔ)。

表3 大腸桿菌DH1基因組中的非必需區(qū)域

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