李 冉，張宇峰

（天津工業(yè)大學(xué)中空纖維膜材料與膜過程省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津 300387）

隨著人們對(duì)生活質(zhì)量和健康的日益重視，益生菌對(duì)人類疾病的預(yù)防和改善正在逐漸被人們所認(rèn)識(shí)和接受.其中鼠李糖乳桿菌GG（LGG）是從健康的人類腸道中分離出來的一種革蘭氏陽(yáng)性菌，并且是首批被證實(shí)能夠在人體腸道存活并定植的益生菌之一[1-3].LGG具有預(yù)防或改善腹瀉、緩解不耐乳糖癥狀、預(yù)防生殖系統(tǒng)感染、增強(qiáng)機(jī)體防御功能、調(diào)節(jié)腸道消化系統(tǒng)健康、降低血清膽固醇、促進(jìn)吸收營(yíng)養(yǎng)成分、預(yù)防癌癥和抑制腫瘤生長(zhǎng)等作用[4].Yan等[5-6]證明LGG還可以預(yù)防和治療細(xì)胞因子誘導(dǎo)的腸道上皮損傷、細(xì)胞凋亡、慢性和急性結(jié)腸炎.目前，國(guó)外已開發(fā)出大量的益生菌保健產(chǎn)品，如酸牛奶、口服液、片劑、膠囊、粉末劑、抑菌噴劑等，國(guó)內(nèi)也將其應(yīng)用在食品、醫(yī)藥保健和飼料等領(lǐng)域.但是要使益生菌得到進(jìn)一步應(yīng)用，仍面臨一系列技術(shù)難題，即如何提高它的存活率，如何使其安然無恙地通過人類胃腸道到達(dá)結(jié)腸等.因此，目前亟待解決的問題就是探究一種可以攜帶益生菌、并可以提高益生菌存活率的載體，幫助其通過胃腸道到達(dá)結(jié)腸并釋放.天然多糖果膠由于具有可以安全通過胃腸道并可被腸道微生物群降解等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛關(guān)注[7-10]，且微囊包封技術(shù)可以在很大程度上提高益生菌產(chǎn)品的耐儲(chǔ)藏、耐加工性能，是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn).微囊包封益生菌主要應(yīng)用物理屏障包裹活細(xì)胞，理想狀態(tài)是微囊在所有的不利外部條件下保護(hù)益生菌不受傷害，如生產(chǎn)過程、儲(chǔ)存和通過消化道等，并且本身不能對(duì)益生菌有傷害作用.目前應(yīng)用于微囊技術(shù)的材料主要有海藻酸鈉、玉米醇溶蛋白、殼聚糖等.其中玉米醇溶蛋白需用乙醇溶解[11]，殼聚糖需用醋酸溶解[10]，都不利于活細(xì)胞的生存，但果膠是一種完全無毒無害的天然食品添加劑和耐酸的乳凝劑，加入少量果膠就可改善口感和風(fēng)味，顯著提高食品質(zhì)量.果膠對(duì)高血壓等慢性病有一定治療作用，并可降低血糖、血脂，減少膽固醇，解除鉛中毒,還有防癌、抗癌等作用.果膠廣泛存在于果皮中，尤其是柑橘類果皮，果皮是數(shù)量最多的廢棄物之一，因此，如能變廢為寶，充分利用果膠于食品中具有重要的研究意義[7].本文首次采用果膠鈣交聯(lián)微球包埋LGG，并考察了不同干燥方法對(duì)微球的釋放性能和儲(chǔ)藏存活率的影響.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

柑橘果膠LC950，酯化度為32%，由Danisco USA Inc提供；卵磷脂，Zenobia Company提供；氯化鈉，氫氧化鈉，鹽酸，氯化鉀，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉，氯化鈣，均為分析純，由Mallinckrodt Specialty Chemicals Co提供；?；悄懰徕c，馬來酸，由Sigma–Aldrich Chemical Co提供；鼠李糖乳酸桿菌GG（LGG），由American TypeCultureCollection53103提供；乳酸桿菌MRS瓊脂，乳酸桿菌MRS肉湯，由Becton，Dickinson and Company提供.由Sigma－Aldrich Chemical Co提供的來自黑曲霉的果膠酶在使用前用0.45 μm的過濾器進(jìn)行過濾.

1.2 制備包埋LGG的載體微球

將LGG放在乳酸桿菌MRS肉湯中，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，用胨水離心洗滌2次，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%氯化鈉溶解稀釋至含菌量遠(yuǎn)到109CFU/mL.

在室溫下，采用Eppendorf公司的epMotion 5070儀器將含有一定濃度LGG和不同濃度葡萄糖的果膠（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%）溶液滴入氯化鈣（5%）溶液中并攪拌，微球迅速形成，攪拌反應(yīng)15 min后用去離子水反復(fù)沖洗，直到洗液中不再含有氯化鈣.將洗滌后的小球分為3組:第1組放入密封袋中保存；第2組放在室溫下空氣干燥；第3組先放入含有干冰的乙醇浴里預(yù)凍，再放入Labconco公司的FreeZone凍干機(jī)中冷凍干燥.

1.3 冷凍干燥

制得含有不同濃度的葡萄糖載體微球后，將其放在凍干機(jī)上冷凍干燥不同時(shí)間后，每組任意取10個(gè)小球稱重，重復(fù)至少3組，再任意取10個(gè)小球放入含有果膠酶（63 FDU/mL）的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，用Interscience公司的拍打式勻漿器加快溶解小球從而釋放LGG，然后按10倍遞增稀釋含有LGG的PBS溶劑直到所需稀釋度.在乳酸桿菌MRS瓊脂中進(jìn)行平板培養(yǎng)，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后用平板測(cè)數(shù)的方法計(jì)算經(jīng)冷凍干燥后微球中所剩LGG的活菌數(shù).

1.4 體外釋放

將室溫空氣干燥和冷凍干燥的2組微球依次放入模擬人類胃腸道的溶劑中，溶劑組分和條件如表1所示.在37℃培養(yǎng)搖床（New Brunswick Scientific公司的innova TM4430）中培養(yǎng)，在模擬結(jié)腸環(huán)境的溶劑中加入果膠酶（63 FDU/mL）幫助溶解果膠釋放LGG.在相應(yīng)的時(shí)間，每一組隨機(jī)取出5個(gè)微球，用Nikon公司的SMZ1500體視顯微鏡拍照，并用ImageJ2x軟件計(jì)算出微球的橫截面面積.

表1 模擬人類胃腸道的溶劑組分和條件Tab.1 Compositions and conditions of simulated human gastrointestinal solution

1.5 LGG在載體微球中的存活率

為了考察儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)載體微球中LGG活性的影響，將3組不同儲(chǔ)存方式的微球保存在室溫下不同時(shí)間后，每次取10個(gè)小球放入含有果膠酶（63 FDU/mL）的PBS溶液中，用拍打式勻漿器加快溶解小球從而釋放LGG，然后按10倍遞增稀釋含有LGG的PBS溶劑直到所需稀釋度，平板培養(yǎng)在乳酸桿菌MRS瓊脂中，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后用平板測(cè)數(shù)的方法計(jì)算經(jīng)冷凍干燥后微球中所剩LGG的活菌數(shù).

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 冷凍干燥時(shí)間及微球含糖量對(duì)LGG存活率的影響

圖1所示為L(zhǎng)GG微球質(zhì)量隨冷凍干燥時(shí)間的變化情況.

由圖1可見，冷凍干燥時(shí)間為0～4 h時(shí)，微球的質(zhì)量呈直線下降，當(dāng)冷凍干燥4 h后，微球的質(zhì)量保持不變，此時(shí)可知，微球已經(jīng)完全干燥.而且微球內(nèi)含糖量對(duì)質(zhì)量變化沒有影響.

圖1 LGG微球質(zhì)量隨冷凍干燥時(shí)間的變化Fig.1 Weight change of LGG and freeze dried time

圖2所示為冷凍干燥時(shí)間及微球含糖量對(duì)LGG存活率的影響.

圖2 冷凍干燥時(shí)間及微球含糖量對(duì)LGG存活率的影響Fig.2 Effect of freeze dry time and concentration of glucose on survivability of LGG in freeze dried pectin/Ca2+beads

由圖2可見，在冷凍干燥2 h時(shí)，LGG量有所增加，此時(shí)可能由于微球還未完全干燥，LGG處于可以滿足其生長(zhǎng)的環(huán)境下，因此LGG量略有增加，當(dāng)冷凍干燥2 h后，LGG存活率迅速下降，5～24 h趨于平緩，在24 h后，LGG的存活率達(dá)到平衡，這表明微球內(nèi)LGG的量基本保持不變；另外，當(dāng)冷凍干燥4 h，含糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，LGG的存活率顯著高于含糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%和20%時(shí)（p＜0.05）.綜合兩者可知，當(dāng)冷凍干燥時(shí)間為4 h，含糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，微球完全干燥，并且微球干燥后的含菌量達(dá)到最大值.

2.2 體外模擬釋放過程中微球的形態(tài)變化

圖3所示為體外釋放過程中冷凍干燥和空氣干燥的微球的形態(tài)變化.

由圖3可見，干燥后的微球呈球型，其中空氣干燥后的微球表面光滑并且沒有可見的裂痕或瑕疵，而冷凍干燥后的微球表面有孔洞，這可能是由于在果膠和氯化鈣交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的過程中，果膠也會(huì)與水分子形成氫鍵，在冷凍干燥時(shí)，結(jié)合水的氫鍵斷裂導(dǎo)致微球形成孔洞.微球經(jīng)過胃腸模擬溶液后仍保持完整，無可見裂痕，這表明果膠鈣微球不會(huì)在胃腸上部降解.當(dāng)微球進(jìn)入結(jié)腸模擬溶劑初期，微球變小但仍保持完整，此時(shí)可能已經(jīng)釋放少量LGG，7 h后，微球碎裂呈小塊，這表明果膠鈣微球可以被降解并釋放LGG.

圖3 體外模擬釋放過程中冷凍干燥和空氣干燥的微球的形態(tài)變化Fig.3 Morphological change of air dried（left）or freeze dried（right）pectin/Ca2+beads in vitro release process

2.3 體外模擬釋放過程中微球的溶脹度

體外模擬釋放過程中冷凍干燥和空氣干燥微球的橫截面積變化如圖4所示.

圖4 體外模擬釋放過程中冷凍干燥和空氣干燥微球的橫截面積變化Fig.4 Area change of freeze dried or air dried pectin/Ca2+beads in vitro release process

由圖4可見，空氣干燥后的微球體積小于冷凍干燥后的微球.在胃部和小腸模擬溶劑中，2種干燥方法干燥后的果膠鈣微球的橫截面積增長(zhǎng)緩慢，當(dāng)微球到達(dá)結(jié)腸模擬溶劑后，橫截面積顯著增大.由于微球的橫截面積和溶脹度呈正比，因此微球在結(jié)腸模擬溶劑中的溶脹度顯著增加，其中冷凍干燥微球的溶脹度小于空氣干燥微球.微球體積逐漸增大，可能導(dǎo)致微球脹破從而釋放LGG.

2.4 體外模擬釋放過程中微球的釋放性能

當(dāng)結(jié)腸模擬溶劑中加入果膠酶后，微球的橫截面積變化如圖5所示.

圖5 體外模擬釋放過程中冷凍干燥和空氣干燥微球的釋放性能Fig.5 Release properties of freeze dried or air dried pectin/Ca2+beads in vitro release process

由圖5可見，2種干燥方法干燥后的果膠鈣微球都可以被快速降解.這表明人類食用果膠鈣微球后，體內(nèi)腸道中的微生物可以降解果膠鈣微球釋放LGG.

2.5 LGG在載體微球中的存活率

干燥過程中水分的喪失不可避免地會(huì)造成部分菌體細(xì)胞的損傷甚至死亡，但冷凍干燥過程仍使微生物細(xì)胞內(nèi)的酶保有活性，且微球的骨架結(jié)構(gòu)保持不變，具有多孔結(jié)構(gòu).為了提高微生物真空冷凍干燥后細(xì)胞的存活率，常在冷凍干燥時(shí)加入各種保護(hù)劑，這些保護(hù)劑在復(fù)水過程中可以作為支持物和受體，并且保護(hù)活細(xì)胞.本實(shí)驗(yàn)采用添加葡萄糖作為真空冷凍干燥保護(hù)劑，它在冷凍干燥過程中保留少量水分使微生物適應(yīng)超低溫、干燥、低pH等能抑制或致死微生物的不良環(huán)境，LGG在載體微球中的存活率如圖6所示.

圖6 LGG在載體微球中的存活率Fig.6 Survivability of LGG in pectin/Ca2+beads

由圖6可見，經(jīng)過6 d的常溫貯藏，未干燥和空氣干燥的微球中LGG含量大概降低3個(gè)數(shù)量級(jí)，而冷凍干燥需14 d左右才降低相同的量.這表明冷凍干燥法是長(zhǎng)期保存含有LGG微球的較好方法.

3 結(jié)論

（1）冷凍干燥最佳條件為:冷凍干燥時(shí)間4 h，微球含糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%.此時(shí)，微球基本完全干燥，且干燥后微球內(nèi)含菌量達(dá)到最大值.

（2）體外模擬釋放結(jié)果表明果膠鈣微球在胃腸上部未降解，在結(jié)腸被降解并釋放LGG.

（3）本實(shí)驗(yàn)采用的2種干燥方法和未干燥方法相比，冷凍干燥法是長(zhǎng)期保存含有LGG微球的最好方法.

[1]YAN F，POLK D B.Probiotics:Progress toward novel therapies for intestinal diseases[J].Curr Opin Gastroenterol，2010，26（2）:95-101.

[2]YAN F，POLK D B.Probiotics as functional food in the treatment of diarrhea[J].Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2006，9（6）:717-721.

[3]錢程，霍貴成，馬微.鼠李糖乳桿菌（LGG）的功能特性及其應(yīng)用前景[J].食品科技，2005，30（9）:94-98.

[4]宋士良.益生菌在食品中應(yīng)用狀況及安全性評(píng)估[J].食品科技，2009，34（7）:22-26.

[5]YAN F，POLK D B.Probiotic bacterium prevents cytokine-induced apoptosis in intestinal epithelial cells[J].J Biol Chem，2002，277（52）:50959-50965.

[6]YAN F，CAO H，COVER T L，et al.Colon-specific delivery of a probiotic-derived soluble protein ameliorates intestinal inflammation in mice through an EGFR-dependent mechanism[J].J Clin Invest，2011，121:2242-2253.

[7]LIU L S，F(xiàn)ISHMAN M L，KOST J，et al.Pectin-based systems for colon-specific drug delivery via oral route[J].Biomaterials，2003，24（19）:3333-3343.

[8]LIU L S，F(xiàn)ISHMAN M L，HICKS K B，et al.Interaction of various pectin formulations with porcine colonic tissues[J].Biomaterials，2005，26:5907-5916.

[9]LIU L S，CHEN G，F(xiàn)ISHMAN M L，et al.Pectin gel vehicles for controlled fragrance delivery[J].Drug Delivery，2005，12:149-157.

[10]SINHA V R，KUMIRA R.Polysaccharides in colon-specific drug delivery[J].Int J Pharm，2001，224:19-38.

[11]LIU L S，KENDE M，RUTHEL G，et al.Pectin/Zein beads for potential colon-specific drug delivery:synthesis and in vitro evaluation[J].Drug Delivery，2006，13（6）:417-423.